【摘要】：近年來,由肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,MP)引起的上、下呼吸道感染有呈逐年上升的趨勢(shì),并且耐藥性也逐年增加。國(guó)外人體臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滅活疫苗免疫后引發(fā)感染加重,且保護(hù)率低,至今尚未研發(fā)成功MP疫苗。通過體外傳代篩選免疫原性強(qiáng)、毒力低的毒株,對(duì)于探索MP疫苗具有重要意義。[目的]將MP在體外連續(xù)傳代,測(cè)定其毒力、免疫原性、免疫保護(hù)性及其基因序列的變化,為肺炎支原體疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。[方法]將MP(ATCC 15531T)在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)至130代,每代進(jìn)行菌株保藏。對(duì)體外傳代后的MP進(jìn)行生長(zhǎng)特性研究:①通過對(duì)MP進(jìn)行固體培養(yǎng)基培養(yǎng),觀察MP菌落形態(tài)變化;②不同代次MP生長(zhǎng)曲線繪制;③不同代次MP菌數(shù)測(cè)定。每隔十代將MP菌液鼻內(nèi)感染Balb/c雌性小鼠,通過計(jì)算小鼠肺組織中MP活菌數(shù)、濕重肺指數(shù)和組織病理學(xué)評(píng)分(histopathologic score,HPS),統(tǒng)計(jì)學(xué)比對(duì)分析,判定不同代次MP毒力。選取毒力相關(guān)基因(p1、p30、p40、p90、p24、p41、p200、p65、mpn387、hmw1、hmw2、hmw3、top j、、cards、mpn491和glp d),對(duì)不同代次 MP 進(jìn)行基因測(cè)序,查找毒力變化相關(guān)位點(diǎn)。通過皮下免疫和鼻內(nèi)免疫這兩種免疫方式,將第5代、60代、70代和130代肺炎支原體分別將MP 5、MP 60、MP 70和MP 130免疫Balb/c雌性小鼠,然后用MPATCC 15531T第5代進(jìn)行攻毒;通過測(cè)定血清中抗體效價(jià)評(píng)價(jià)免疫原性,及感染后肺組織中MP活菌數(shù)、計(jì)算濕重肺指數(shù)和組織病理學(xué)評(píng)分進(jìn)行免疫保護(hù)力評(píng)定。[結(jié)果]MP經(jīng)過體外傳代培養(yǎng)后MP菌落形態(tài)未發(fā)生變化,都呈現(xiàn)“油煎蛋”形。從生長(zhǎng)曲線和不同代次菌數(shù)測(cè)定可以看出,肺炎支原體經(jīng)過體外傳代后,菌數(shù)增多,初始菌(MP 1)數(shù)為 6.57±0.208X 106 CFU/mL,MP 50 菌數(shù)為 1.98±0.0727X 107 CFU/mL,到了 60 代時(shí)菌數(shù)為 2.34±0.0416X 108 CFU/mL,MP 70-130 穩(wěn)定在 2～4×108 CFU/mL.MP經(jīng)過體外傳代培養(yǎng)后毒力測(cè)定:用不同代次對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行感染,陽性對(duì)照組肺組織活菌數(shù)為1.062×104 CFU/mL,MP 50感染后活菌數(shù)為9.676X 103 CFU/mL,濕重肺指數(shù)(1.05%)、組織病理學(xué)評(píng)分(2.6)與陰性對(duì)照組(分別為0.73%,1.0)都有極顯著差異(p0.01)。MP 60毒力略有降低,感染后活菌數(shù)為1.151 ×103 CFU/mL,但是濕重肺指數(shù)(0.99%)、組織病理學(xué)評(píng)分(2.0)與陰性對(duì)照組有極顯著差異(p0.01)。MP70-130毒力明顯降低,感染后MP活菌數(shù)少于10 CFU/mL,濕重肺指數(shù)(0.77%)、組織病理學(xué)評(píng)分(1.0)與陰性對(duì)照組無顯著差異(p0.05)。體外傳代培養(yǎng)后,p1、p30、p40、p90、p24、p41、p200、p65、mpn387、hmw1、hmw2、hmw3、top j未發(fā)生基因突變。通過體外傳代培養(yǎng)60代,編碼MPN491第64位氨基酸的序列替換為終止密碼子。體外傳代培養(yǎng)70代,編碼HMW1第810位氨基酸的序列替換為終止密碼子。這兩個(gè)基因的變化是否與MP體外連續(xù)傳代減毒有關(guān)需要進(jìn)一步研究。通過鼻內(nèi)免疫1次后測(cè)抗體效價(jià)判定MP的免疫原性,MP60、MP70、MP 130免疫后GMT都為5.25,與MP5(GMT為8.10)無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。鼻內(nèi)和皮下注射免疫后進(jìn)行攻毒試驗(yàn):MP 5、MP 60、MP 70和MP 130鼻內(nèi)免疫后濕重肺指數(shù)(0.92-0.98)、HPS(2.4-3.0)與陰性對(duì)照組(分別為0.73%,1.0)都有極顯著差異(p0.001),無保護(hù)效果。皮下免疫后濕重肺指數(shù)(0.91-0.99)、HPS(1.4)與陰性對(duì)照組(分別為0.83%,1.0)都無顯著性差異(p0.05),說明MP體外連續(xù)傳代皮下免疫后具有保護(hù)效果。通過組織病理學(xué)切片評(píng)分進(jìn)一步計(jì)算皮下免疫后對(duì)肺炎的保護(hù)率,MP 5皮下免疫后保護(hù)率為50%,MP 60、MP 70和MP 130皮下免疫后保護(hù)率都為60%。測(cè)定攻毒后肺組織中MP活菌數(shù),發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)和皮下免疫都能清除部分攻毒時(shí)進(jìn)入MP:鼻內(nèi)免疫時(shí),MP5免疫能清除93.97%的MP,MP60免疫能清除97.91%的MP,MP 70免疫后清除MP的能力降低,只能清除63.27%的MP。皮下免疫后MP5免疫只能清除65.76%的MP,MP60、MP70和MP130免疫后清除率分別為73.42%、64.43%和78.9%。表明皮下免疫對(duì)MP的清除能力相較于鼻內(nèi)免疫有所降低。[結(jié)論]1.MP通過體外連續(xù)傳代培養(yǎng),菌落形態(tài)未發(fā)生變化,細(xì)胞數(shù)量從6×106 CFU/mL 提升到4×1 08 CFU/mL。2.MP通過體外連續(xù)傳代培養(yǎng),MP60毒力略有降低,MP70-130感染Balb/c小鼠后濕重肺指數(shù)、組織病理學(xué)評(píng)分與陰性對(duì)照無顯著性差異(p0.05),毒力明顯降低。3.MP體外傳代培養(yǎng)至60代時(shí),編碼MPN491第64位氨基酸的序列替換為終止密碼子。體外傳代培養(yǎng)至70代時(shí),編碼HMW1第810位氨基酸的序列替換為終止密碼子。4.MP 60、MP 70和MP 130通過皮下免疫的方式免疫Balb/c小鼠仍有60%的保護(hù)率;而用鼻內(nèi)免疫雖然清除MP的效果好,但炎癥未減輕。
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R375.2
【圖文】：

然后染色體分離，隨后黏附細(xì)胞器會(huì)黏附到一個(gè)表面滑行，使ＭＰ分裂逡逑成兩個(gè)子細(xì)胞［６］。逡逑如圖１所示，肺炎支原體黏附細(xì)胞器至少有十一個(gè)子結(jié)構(gòu)組成。Ｐ１和輔助蛋逡逑白Ｂ邋（Ｐ４０）、Ｃ邋（Ｐ９０）和Ｐ３０存在于肺炎支原體黏附細(xì)胞器的最末端，它們通過逡逑與唾液酸受體結(jié)合黏附到宿主細(xì)胞。Ｐ２４、Ｐ４１、Ｐ２００、ＭＰＮ３８７和ＴｏｐＪ蛋白位逡逑于黏附細(xì)胞器基部，形成碗狀復(fù)合體。ＨＭＷ１、ＨＭＷ２、ＨＭＷ３和Ｐ６５連接黏逡逑附細(xì)胞器的末端和基部［１（）］。逡逑Ｂｏｗｌ邋ｃｏｍｐｌｅｘ逡逑Ｌｏｎ，邋Ｐ２４，邋Ｔｏｐｉ，邋Ｐ２００，邋Ｐ４１，邋ｍ？Ｎ３Ｂ７ｆ邋（ＨＭＷ２）逡逑／邐Ｐａｉｒｅｄ邋ｐｌａｔｅｓ逡逑／ｈＭＷＩ，邋ＨＭＷ２，邋ＣｐｓＧ，邋（ＨＭＷ３）逡逑Ｉ邋Ｔｅｒｍｉｎａｌ邋ｂｕｔｔｏｎ逡逑ｊＰ邐Ｉ邋（ＨＭＷ２），邋ＨＭＷ３，邋Ｐ６５逡逑？邐逡逑？？？？？？？？？／？？？？？？？？？ｉ逡逑Ｐ３０逡逑Ｍａｐ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑圖１黏附細(xì)胞器包含的蛋白。（圖片來自ＮａｋａｎｅＤ等［ｕ］）逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ邋ｏｒｇａｎｅｌｌｅ邋ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ邋ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（邋Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ邋Ｎａｋａｎｅ逡逑Ｄ．ｅｔ邋ａｌ［，１］）逡逑ＰＩ蛋白大小為１７０ｋＤａ，在黏附細(xì)胞器的末端聚集存在，是ＭＰ與宿主細(xì)胞逡逑相互作用最主要的蛋白ｔ５

結(jié)果逡逑代逡逑代培養(yǎng)逡逑體外傳代培養(yǎng)，ＭＰ的生長(zhǎng)速度逐漸加快，最開始用ＰＰＬＯ逡逑原體需要８４－１０８邋ｈ，傳至６０代左右時(shí)，培養(yǎng)肺炎支原體逡逑０代以后，培養(yǎng)肺炎支原體大約需要４８－６０邋ｈ。逡逑鑒定逡逑附實(shí)驗(yàn)逡逑２５０倍觀察，發(fā)現(xiàn)豚鼠紅細(xì)胞吸附在菌落表面，證明該菌逡逑（圖２）。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 方炳武;曾堅(jiān)生;;阿奇霉素和紅霉素治療小兒支原體肺炎的優(yōu)劣分析[J];現(xiàn)代診斷與治療;2015年15期

2 蒙日安;;阿奇霉素聯(lián)合大劑量維生素C治療小兒支原體肺炎的療效研究[J];臨床合理用藥雜志;2014年15期

本文編號(hào)：2714275