【摘要】：Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)在哺乳動物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著會重要作用。它們識別不同的微生物進而激活天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng),控制機體的免疫反應(yīng)。其中TLR4介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的異�；罨c許多難治性疾病(如：腫瘤、病毒感染、自身免疫病等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而臨床上針對這一通路的治療藥物非常有限。因此,發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控TLR4信號通路的小分子化合物,并深入研究其調(diào)控特點與機制,將有可能開發(fā)出新的藥物,為這些疾病的治療帶來新的希望。 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)是TLR4最典型的配體,能激活TLR4信號通路,產(chǎn)生大量炎性因子。于是我們建立了LPS誘導(dǎo)的小鼠單核/巨噬細胞RAW264.7模型,通過流式細胞術(shù)胞內(nèi)因子檢測的方法,從一系列海洋來源的共生菌產(chǎn)物中篩選能抑制該模型腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)產(chǎn)生的小分子化合物。我們篩選出幾個化合物能抑制TNF-α和MCP-1的表達,其中化合物bis-N-norgliovictin(來自海洋真菌的二酮哌嗪類化合物)效果最明顯。基于此,我們對bis-N-norgliovictin抗炎作用的特點和機制進行了進一步探索。 首先,我們用CCK-8試劑檢測細胞活力,發(fā)現(xiàn)bis-N-norgliovictin (0.5～16μg/ml)對RAW264.7細胞的活力無影響,說明bis-N-norgliovictin的抗炎作用與其細胞毒性無關(guān)；接著,用ELISA或流式細胞術(shù)分析不同濃度bis-N-norgliovictin (0.5、1、2μg/ml)對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞TNF-α、IL-6、MCP-1和IFN-β產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示,bis-N-norgliovictin對這些炎性因子均有不同程度的抑制作用；熒光定量PCR分析結(jié)果表明,bis-N-norgliovictin劑量依賴性地抑制炎性炎性因子mRNA的表達水平；同時,我們還發(fā)現(xiàn)bis-N-norgliovictin對小鼠腹腔巨噬細胞和LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥模型具有類似的抗炎作用。流式細胞術(shù)檢測小鼠腹腔巨噬細胞對FITC-LPS的結(jié)合和內(nèi)吞能力,發(fā)現(xiàn)bis-N-norgliovictin (0.5、2μg/ml)對其并無影響,說明,bis-N-norgliovictin不改變巨噬細胞的信號識別和吞噬功能。 TLR4誘導(dǎo)兩條不同的信號通路,分別由MyD88和TRIF來介導(dǎo)。其中MyD88依賴的信號通路主要經(jīng)過MAPKs和NF-κB,最終產(chǎn)生致炎因子(如TNF-α、IL-6); TRIF依賴的信號通路除上述MAPKs和NF-κB外,還經(jīng)過干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3),最終產(chǎn)生Ⅰ型干擾素和干擾素誘導(dǎo)基因(如IFN-β、IP-10)。上述實驗結(jié)果已表明,bis-N-norgliovictin對MyD88和TRIF依賴的兩條通路的產(chǎn)物都有抑制作用,這就提示我們,該化合物可能對這兩條通路都起調(diào)控作用。接下來我們從這兩條通路出發(fā)研究bis-N-norgliovictin的作用機制。 用Western Blot法分析RAW264.7細胞NF-κB上游IκBα的磷酸化水平和降解情況,結(jié)果顯示,bis-N-norgliovictin (2μg/ml)能顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的IκBα的磷酸化和降解水平；免疫熒光法觀察到bis-N-norgliovictin減少LPS誘導(dǎo)的NF-κB的入核；同時,bis-N-norgliovictin能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的MAPKs中JNK和p38的磷酸化,而對ERK的磷酸化幾乎不影響；熒光報告基因檢測發(fā)現(xiàn),bis-N-norgliovictin降低LPS誘導(dǎo)的AP-1的活性；另一方面,bis-N-norgliovictin對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞IRF3的磷酸化也起一定的抑制作用。 綜上所述,篩選出的小分子化合物bis-N-norgliovictin能有效抑制TLR4介導(dǎo)的巨噬細胞炎癥通路的活化,對TLR4通路中MyD88和TRIF兩條途徑均有下調(diào)作用。所有結(jié)果提示,bis-N-norgliovictin是一個新的TLR4通路的小分子抑制劑,它有可能成為治療TLR4相關(guān)疾病的候選化合物。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392.1
【圖文】：

..止12冰60忍0dJ00u護od.芝歲。刀口ua。daJ把的塵do滬·do芝圖2-3的影響不同小分子化合物對LPS誘導(dǎo)的RAW衛(wèi)64.7細胞產(chǎn)生TNF一a和MCP一lFigZ一 3Effeetsofdifferentsmall一 moleeuleeomPoundsonLPSindueedProduetions ofINF一 aandMCP一 1inRAW264.7eells.#P<0.05eomParedtoeontrol;*P<0.05 c01llParedtoLPSalone

3.4實驗結(jié)果與分析3.4.1Bis一N一norg一iovietin不影響巨噬細胞的細胞活力在篩選過程中發(fā)現(xiàn)D14即bis一N一norgliovietin對LpS誘導(dǎo)的TNF一a和具有抑制作用，且在實驗過程中，用倒置顯微鏡觀察并未發(fā)現(xiàn)該化合物對態(tài)有明顯的影響。為了排除bis一N一norgliovictin的抑炎作用是由于其細胞起的可能性，本實驗采用CCk一8法檢測細胞活力。如圖2一2所bis一N一norgliovietin0.5一16林g/ml分別處理細胞sh、24h、48h，與溶劑對照均無顯著差異(p>0.05)。說明bis一N一norgliovietin在16林g/ml以下對細胞無其抗炎作用與細胞毒性無關(guān)。

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本文編號：2713200