發(fā)布時(shí)間：2020-06-14 08:51

【摘要】：腦梗死又稱為缺血性腦卒中,是由于供應(yīng)腦部的血流中斷,導(dǎo)致腦組織缺少氧氣和葡萄糖供應(yīng),而引起的局灶性組織壞死和軟化,其特點(diǎn)發(fā)病率高、致殘率高、致死率高、復(fù)發(fā)率高。中國(guó)導(dǎo)致過(guò)早死亡損失壽命年(YLLs)最高的原因是卒中。隨著全球人口老齡化日益嚴(yán)重,缺血性腦卒中的發(fā)病率逐年增高,且有年輕化的趨勢(shì),已成為世界上最重要的健康問(wèn)題之一。雖然靜脈溶栓治療是目前恢復(fù)腦血流供應(yīng)的最重要的措施,但治療時(shí)間窗較窄、禁忌證較多、有一定的出血風(fēng)險(xiǎn),大部分患者不能應(yīng)用。因此,如何預(yù)防腦梗死的發(fā)生,梗死發(fā)生后如何減輕繼發(fā)性的腦損傷成為我們重要研究課題之一。腦梗死時(shí)機(jī)體產(chǎn)生的自由基會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激反應(yīng)的加劇,減少自由基的產(chǎn)生,尋找抗氧化應(yīng)激藥物對(duì)預(yù)防和治療缺血性腦卒中有重要意義。阿托伐他汀是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-Co A)還原酶的選擇性、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,具有多種作用:降低膽固醇合成,進(jìn)而反饋性增強(qiáng)細(xì)胞表面低密度脂蛋白(LDL)受體的表達(dá);抑制極低密度蛋白膽固醇(VLDL-C)合成;減少脂質(zhì)浸潤(rùn)和泡沫形成,減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的體積,誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊逆轉(zhuǎn),從而改善缺血;抑制巨噬細(xì)胞趨化因子表達(dá)和分泌,阻止單核細(xì)胞及其它炎性細(xì)胞浸潤(rùn),從而發(fā)揮抗炎作用;改善血管內(nèi)皮功能等,特別是其抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用,通過(guò)清除自由基,降低斑塊內(nèi)LDL的氧化易感性,在缺血性腦卒中后發(fā)揮了重要的腦保護(hù)作用。但阿托伐他汀抗氧化的分子機(jī)制目前尚不十分明確。我們的前期研究表明阿托伐他汀可以上調(diào)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠大腦皮層核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)的表達(dá)。NRF2屬于Cap-n-collar(CNC)轉(zhuǎn)錄因子家族,包括6個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域Nrf2-ECH homology(Neh)。它是細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要因子,在細(xì)胞質(zhì)中受Keap1的調(diào)控,激活后,與Keap1解離,入核后通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件ARE(antioxidant response element)相互作用,調(diào)控抗氧化蛋白和II相酶類的表達(dá)。自噬是一種受溶酶體控制的可以清除受損或老化細(xì)胞的現(xiàn)象,使細(xì)胞在多重應(yīng)激狀態(tài)下,保持內(nèi)穩(wěn)態(tài),得以生存。許多因素會(huì)影響自噬,包括氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、老化等,也有很多研究表明缺血性腦卒中后會(huì)有自噬的調(diào)節(jié)和改變。本課題選用8~12周齡健康雄性ICR小鼠為研究對(duì)象,采用電凝法制備遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈閉塞(distal middle cerebral artery occlusion,dMCAO)模型。在本課題中,主要研究阿托伐他汀是否改善腦缺血后神經(jīng)功能損傷,抗氧化應(yīng)激作用,對(duì)自噬的調(diào)節(jié),以及Nrf2信號(hào)通路及其下游相關(guān)因子是否參與其中。本課題分為三部分,各部分內(nèi)容概述如下。第一部分阿托伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠模型的神經(jīng)功能恢復(fù)、腦保護(hù)作用目的:觀察給予阿托伐他汀后實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的神經(jīng)功能缺損、腦梗死體積、腦含水量、腦血流量的變化,研究阿托伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。方法:選用8~12周齡健康雄性ICR小鼠為研究對(duì)象,采用電凝法制備dMCAO模型。實(shí)驗(yàn)一:將ICR小鼠隨機(jī)分為以下各組:假手術(shù)組(Sham):動(dòng)物接受假手術(shù)和等體積的生理鹽水;手術(shù)組(Vehicle):動(dòng)物接受dMCAO和等體積的生理鹽水;阿托伐他汀低劑量組(AtorvL):動(dòng)物接受dMCAO,并給予10 mg/kg阿托伐他汀;阿托伐他汀中劑量組(Atorv-M):動(dòng)物接受dMCAO,并給予20 mg/kg阿托伐他汀;阿托伐他汀高劑量組(Atorv-H):動(dòng)物接受dMCAO,并給予40mg/kg阿托伐他汀。術(shù)前7天開始每日給予阿托伐他汀灌胃直至取材,分別于術(shù)前、術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)對(duì)各組小鼠進(jìn)行RotaRod、mNSS神經(jīng)功能評(píng)分,同時(shí)測(cè)量體重變化。實(shí)驗(yàn)二:將ICR小鼠隨機(jī)分為以下各組:手術(shù)組(Vehicle)和阿托伐他汀中劑量組(Atorv),于術(shù)后72小時(shí)用TTC染色法測(cè)定腦梗死體積,干濕重法測(cè)定腦組織含水量,于術(shù)前、術(shù)后即刻、24小時(shí)、72小時(shí)使用激光散斑成像儀監(jiān)測(cè)腦血流量(CBF)。結(jié)果:1.Rota-Rod實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:除Sham組以外,在術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí),與Vehicle組相比,Atorv-M組均明顯改善了神經(jīng)功能損傷(P0.01),Atorv-L組與Vehicle組相比僅術(shù)后72小時(shí)表現(xiàn)較好(P0.05),Atorv-H組在術(shù)后48小時(shí)、72小時(shí)均好于Vehicle組(P0.05),但Atorv-M組與Atorv-H組在48小時(shí)、72小時(shí)相比,神經(jīng)功能恢復(fù)較好(P0.05)。2.mNSS結(jié)果顯示:在術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí),Vehicle組和Atorv各組之間均沒有顯著差異。在術(shù)后72小時(shí),Atorv-M組與Vehicle組、Atorv-L組小鼠的神經(jīng)缺陷評(píng)分差異有顯著性(P0.05),與Atorv-H組沒有顯著性差異。余各組之間mNSS評(píng)分在各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著性差異。體重變化結(jié)果顯示:接受手術(shù)后各組小鼠的體重在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)均有下降,然而,五組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。根據(jù)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇阿托伐他汀20 mg/kg進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.TTC染色結(jié)果顯示:在dMCAO后72小時(shí),Atorv組小鼠的腦梗塞體積顯著小于Vehicle組(P0.01)。腦含水量測(cè)定結(jié)果顯示:在dMCAO后72小時(shí),Atorv組小鼠腦含水量明顯高于sham組(P0.05)、但明顯低于Vehicle組(P0.01)。4.激光散斑腦血流量測(cè)量結(jié)果顯示:小鼠術(shù)后左側(cè)大腦半球的腦灌注量下降至約95%,但在右側(cè)大腦半球腦灌注量立即明顯下降至約55%(P0.01)。右側(cè)皮層大腦中動(dòng)脈供血區(qū),腦灌注量隨著時(shí)間逐漸恢復(fù),atorv組小鼠較Vehicle組恢復(fù)更快,但兩組小鼠之間腦灌注量各時(shí)間點(diǎn)均未無(wú)明顯差異。第二部分阿托伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠模型氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及對(duì)自噬相關(guān)因子的影響目的:觀察給予阿托伐他汀鈣后實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠腦組織各氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化,Nrf2的表達(dá)水平以及自噬相關(guān)指標(biāo)LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)水平。方法:選用8~12周齡健康雄性ICR小鼠為研究對(duì)象,采用電凝法建立dMCAO模型。將ICR小鼠隨機(jī)分為以下各組:假手術(shù)組(Sham),Vehicle組(Vehicle)和阿托伐他汀組(Atorv)。實(shí)驗(yàn)一:于術(shù)后72小時(shí)取材測(cè)定SOD、MDA、CAT、GSH的含量。實(shí)驗(yàn)二:于術(shù)后72小時(shí)取材應(yīng)用Western Blot的方法測(cè)定胞漿、胞核Nrf2蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)三:于術(shù)后72小時(shí)取材應(yīng)用Western Blot的方法測(cè)定LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)水平。結(jié)果:1.各組小鼠同側(cè)大腦皮層中SOD、CAT、GSH的含量檢測(cè)結(jié)果顯示:腦缺血后72小時(shí),Atorv組與Sham組、Vehicle組相比,SOD的含量明顯增加(P0.01),Sham組與Vehicle組小鼠SOD含量無(wú)顯著差異。Atorv組較Vehicle組相比,CAT明顯增加(P0.01),GSH含量也明顯增加(P0.05),Atorv組與Sham組小鼠CAT、GSH含量無(wú)顯著性差異(P0.05)。2.各組小鼠同側(cè)大腦皮層中MDA的含量檢測(cè)結(jié)果顯示:腦缺血后72小時(shí),Vehicle組與Sham組、Atorv組小鼠相比,MDA的含量明顯增加(P0.01)。Atorv組較Sham組相比,MDA的含量雖有升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.Western blot結(jié)果顯示:在術(shù)后72小時(shí),各組胞漿Nrf2蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著差異(P0.05)。與Sham組相比,Vehicle組、Atorv組胞核Nrf2蛋白表達(dá)顯著增加(P0.01)。Atorv組胞核Nrf2蛋白表達(dá)較Vehicle組顯著增加(P0.05)。4.Western blot結(jié)果顯示:在術(shù)后72小時(shí),LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值A(chǔ)torv組較Sham組、Vehicle組均升高(P0.01),Beclin1的表達(dá)水平Atorv組較Sham組、Vehicle組均升高(P0.01),Sham組與Vehicle組相比LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值、Beclin1的表達(dá)水平均無(wú)顯著性差異。第三部分阿托伐他汀通過(guò)Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的相關(guān)機(jī)制研究目的:通過(guò)測(cè)定各組小鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦梗死體積及Nrf2信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)水平,觀察Nrf2信號(hào)通路是否參與了阿托伐他汀對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦梗死小鼠的抗氧化應(yīng)激作用。方法:采用8~12周齡成年雄性野生型ICR小鼠(Nrf2+/+)與以ICR為背景的Nrf2敲除小鼠(Nrf2-/-)為研究對(duì)象,通過(guò)電凝法建立dMCAO模型。將Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠分別隨機(jī)分為以下3組:假手術(shù)組(Sham)、Vehicle組(Vehicle)和阿托伐他汀組(Atorv)。于術(shù)后72小時(shí)進(jìn)行Rota-Rod、mNSS神經(jīng)功能評(píng)分,TTC染色法測(cè)定腦梗死體積,試劑盒測(cè)定SOD活力,通過(guò)Western Blot測(cè)定HO-1、NQO-1、P62的表達(dá)。結(jié)果:1.所有小鼠均進(jìn)行基因型鑒定,鑒定結(jié)果出現(xiàn)一條400 bp左右條帶,為純合子,Nrf2-/-小鼠;出現(xiàn)750 bp和400 bp條帶,為雜合子,即Nrf2+/-小鼠;出現(xiàn)一條750 bp左右條帶,為野生型,即Nrf2+/+小鼠。2.Rota-Rod結(jié)果顯示,在術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí),阿托伐他汀處理的Nrf2+/+小鼠神經(jīng)功能缺損均明顯輕于其余各組(P0.01),阿托伐他汀處理的Nrf2-/-小鼠神經(jīng)功能缺損僅在72小時(shí)較Nrf2-/-Vehicle組小鼠有差異(P0.01),但仍明顯較阿托伐他汀Nrf2+/+小鼠恢復(fù)慢(P0.01)。mNSS評(píng)分結(jié)果顯示:術(shù)后24小時(shí)各組小鼠評(píng)分均無(wú)顯著性差異,術(shù)后48小時(shí)、72小時(shí),Nrf2+/+和Nrf2-/-小鼠評(píng)分阿托伐他汀組均低于Vehicle組。3.SOD活力檢測(cè)結(jié)果顯示,在術(shù)后72小時(shí),Nrf2+/+Atorv組小鼠梗死側(cè)皮層SOD活力顯著高于其他各組(P0.01),其余各組間差異無(wú)顯著性。4.Western blot結(jié)果顯示:在術(shù)后72小時(shí),Nrf2+/+Sham組HO-1含量明顯低于其余各組(P0.01),Nrf2+/+Atorv組HO-1含量明顯高于其余各組(P0.01),余各組間無(wú)顯著性差異。Nrf2-/-Sham組NQO1含量明顯低于其余各組(P0.01),Nrf2+/+Atorv組NQO1含量明顯高于其余各組(P0.01),余各組間無(wú)顯著性差異。Nrf2+/+Atorv組P62含量較Nrf2+/+Sham組、Nrf2+/+Vehicle組升高(P0.01),而Nrf2-/-Atorv組P62含量較Nrf2-/-Sham組、Nrf2-/-Vehicle組降低。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)成功在健康雄性ICR小鼠建立電凝法局灶性永久腦梗死模型,成功建立起Nrf2-/-小鼠的繁殖鑒定技術(shù)。發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀20 mg/kg灌胃可以顯著改善小鼠的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn),減少腦梗死體積,減輕腦水腫,阿托伐他汀20 mg/kg給藥具有腦保護(hù)作用。2.阿托伐他汀干預(yù)可以改善小鼠缺血半暗帶區(qū)腦血流灌注量,具有抗氧化應(yīng)激作用。3.阿托伐他汀可以上調(diào)自噬相關(guān)基因,可能通過(guò)激活自噬發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。4.阿托伐他汀干預(yù)可以通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路,上調(diào)該通路下游基因HO-1、NQO-1的表達(dá),發(fā)揮抗氧化作用,從而改善腦缺血小鼠的神經(jīng)功能恢復(fù),P62蛋白水平的上調(diào)可能與Nrf2的激活形成正反饋有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R743.3;R-332
【圖文】：

圖 1 阿托伐他汀減輕腦卒中后神經(jīng)功能缺損Fig.1 Atorvastatin reduces neurologic deficit after stroke(A) The rota rod apparatus. (B) Rota-rod test and mNSS assessment. (C) were performed atindicated time points to evaluate neurological deficit (n = 12). (D) The changes of bodyweight were monitored during the experiment procedure (n = 12). Quantitative data areshown as mean ±SEM,★P < 0.05,★★P < 0.01 vs. Vehicle group.

圖 2 阿托伐他汀減小腦卒中后腦梗死體積，減輕腦水腫Fig.2 Atorvstatin relieved brain infarct volume and brain edema after stroke(A) The TTC staining of sham, vehicle and atorv groups at 72 hours after stroke. (B)Quantification of TTC staining brain slices (n = 6). (C) The brain water content test, at 72hours after stroke, brain water content was significantly lower in Atorv-treated mice than invehicle-treated mice (n = 6). Quantitative data are shown as mean ±SEM, P ＜ 0.05, P ＜0.01 vs. Vehicle group.

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本文編號(hào)：2712545