【摘要】：[背景目的] 結(jié)核病(Tuberculosis, TB)目前作為傳染性疾病中的第二號殺手,嚴(yán)重威脅著人類健康；而現(xiàn)有唯一可用的疫苗——卡介苗(Mycobacterium bovis BCG),僅能為未成年兒童提供可靠的保護(hù)性,因此急需發(fā)展可用于成人的新型預(yù)防性疫苗。BCG初免-異源性疫苗增強(qiáng)(BCG prime-Heterologous Boost)策略以及重組卡介苗(RecombinatBCG)策略是現(xiàn)階段認(rèn)為最有希望的兩種免疫策略。因此,闡明這兩種策略的保護(hù)性差異,對于未來結(jié)核病疫苗的研制工作具有指導(dǎo)意義。 本研究擬構(gòu)建一株分泌表達(dá)融合蛋白ESAT-6-Ag85A的重組卡介苗(rBCG::685A)并證實其正確表達(dá)。擬以BCG初免-DNA疫苗pcD685A增強(qiáng)為初免增強(qiáng)組,與rBCG::685A分別免疫小鼠后,比較這兩種策略的免疫原性及保護(hù)性。 [方法] 1.用BamH I及EcoR I酶切真核質(zhì)粒pcD685A,獲取融合基因ESAT-6-Ag85A,將其亞克隆至大腸桿菌-分枝桿菌分泌型載體pMS261,構(gòu)建含有融合基因序列的重組質(zhì)粒pM685A,并經(jīng)測序驗證序列正確； 2.通過電擊法將pM685A質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)BCG中國株,通過Kan抗性篩選陽性克隆,并經(jīng)Western-blotting證實蛋白的正確表達(dá)； 3.將rBCG::685A及BCG初免-pcD685A增強(qiáng)按照各自策略分別免疫C57BL/6小鼠,以PBS為陰性對照,BCG為陽性對照。8周后,分離脾細(xì)胞經(jīng)ELISA檢測PPD及抗原r685A特異性IFN-γ濃度。通過qRT-PCR檢測肺臟IFN-γ、TNF-α、IL-10以及iNOS的表達(dá)情況； 4.免疫8周后,用1×106CFU劑量的M.tb H37Rv經(jīng)尾靜脈攻擊感染。4周后處死小鼠,分別檢測肺臟及脾臟荷菌量；同時取右肺部分組織切片后進(jìn)行常規(guī)HE染色及Ziehl-Neelsen抗酸染色,并對病理改變進(jìn)行評價。 [結(jié)果] 1.攜帶融合基因ESAT-6-Ag85A的穿梭質(zhì)粒pM685A被成功構(gòu)建,通過酶切鑒定及基因測序證實。 2.通過Western-blotting證實在rBCG::685A培養(yǎng)上清中有38kDa的r685A蛋白表達(dá),表示分泌表達(dá)融合蛋白的重組卡介苗rBCG::685A被成功構(gòu)建。 3.不同疫苗免疫小鼠8周后,ELISA檢測小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中特異性IFN-γ水平：經(jīng)PPD及r685A刺激后,所有免疫組相對于PBS對照組均產(chǎn)生較高水平的IFN-γ (P0.05):r685A特異性刺激后,BCG初免-pcD685A增強(qiáng)免疫組產(chǎn)生的特異性IFN-γ水平相對于rBCG::685A免疫小鼠明顯升高(P0.05)。 4.對免疫小鼠肺臟不同分子表達(dá)譜進(jìn)行qRT-PCR檢測：與PBS組比較,IN-γ TNF-α、IL-10以及iNOS在不同免疫組小鼠肺臟中表達(dá)水平均上升；與BCG組相比較,BCG初免-DNA疫苗增強(qiáng)免疫組以及rBCG免疫組免疫小鼠肺臟IFN-γ及IL-10表達(dá)水平略有上升；而BCG初免-pcD685A增強(qiáng)免疫組小鼠肺臟TNF-α及iNOS水平相對于BCG組和rBCG::685A組小鼠顯著上升(P0.05)。 5.免疫小鼠經(jīng)M.tb H37Rv攻毒4周后,分析小鼠臟器荷菌量：BCG初免-DNA疫苗增強(qiáng)免疫組小鼠體內(nèi)荷菌量最低(P0.05),而rBCG::685A組小鼠體內(nèi)荷菌量與BCG組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；病理切片鏡下觀,BCG初免-DNA疫苗增強(qiáng)免疫組小鼠肺臟組織病理改變最輕：BCG組和rBCG::685A組中可見散在血管周圍炎及肺泡炎,但相對于PBS組明顯減輕。 [結(jié)論] 1.BCG初免-pcD685A增強(qiáng)策略誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及保護(hù)效應(yīng)明顯優(yōu)于rBCG::685A: 2.未來成人結(jié)核病疫苗的合理設(shè)計需要以BCG或有效的增強(qiáng)型rBCG菌株為初免疫苗、聯(lián)合異源性疫苗增強(qiáng)策略的保護(hù)作用,最終有效的控制TB的發(fā)生。 [背景目的] BCG作為唯一的結(jié)核病預(yù)防疫苗,能較好地預(yù)防嬰幼兒和兒童的結(jié)核性腦膜炎及粟粒樣結(jié)核,但是對預(yù)防成人結(jié)核病的能力有限。前期通過初免增強(qiáng)策略及rBCG策略的比較性研究,我們證實BCG初免-異源性增強(qiáng)策略是一種有效地改善BCG保護(hù)性的手段。因此,急需發(fā)展一種合適的BCG初免后的增強(qiáng)疫苗,以提高其對成人結(jié)核病的預(yù)防效果。 已通過大量動物試驗及臨床研究證實,亞單位蛋白疫苗可能是一種較為有效的預(yù)防結(jié)核病的疫苗類型；結(jié)合M.tb致病性的研究,發(fā)現(xiàn)M.tb在體內(nèi)的致病性可分為不同階段,并在不同階段表達(dá)的抗原譜具有階段特異性；BCG免疫針對其中某些階段的特異性抗原無或弱應(yīng)答。我們假設(shè)選擇M.tb不同階段表達(dá)的抗原構(gòu)建融合蛋白亞單位疫苗,有可能建立針對感染者體內(nèi)不同狀態(tài)M.tb的免疫保護(hù)性,從而既能控制M.tb的原發(fā)感染的發(fā)病,也能夠控制成人結(jié)核病的發(fā)生。 因此,本研究擬選用M.tb感染后各階段特異性蛋白為靶抗原,設(shè)計一條表達(dá)多階段抗原的融合蛋白A1D3R1,聯(lián)合新型佐劑MTO制成亞單位蛋白疫苗A1D3R1/MTO,評價其免疫小鼠的免疫原性及保護(hù)效果。 [方法] 1.基因設(shè)計和合成：M.tb H37Rv基因組涉及的五個基因及各自的序列,分別是：Ag85A、Rv2626c、Rv3407、PhoY2以及RpfB,然后使用分子生物學(xué)相關(guān)軟件對序列進(jìn)行分析和融合,并命名為A1D3R1。設(shè)計好的A1D3R1序列交由公司合成并測序正確。同時設(shè)計特異性PCR引物。 2.原核表達(dá)載體的構(gòu)建,蛋白表達(dá)、純化和定量：構(gòu)建表達(dá)菌株E. coliBL21(DE3)-pET30b-A1D3R1.誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白A1D3R1,通過Ni-NTA親和柱方法純化獲取原核蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western-blotting驗證,通過BCA法定量及去除內(nèi)毒素后用于后續(xù)實驗。 3.全血IFN-γ釋放試驗鑒定抗原能否被M.tb感染人群和未感染人群的T細(xì)胞所識別：收集人群血液樣本,結(jié)合臨床診斷及本課題組前期建立診斷標(biāo)準(zhǔn)將人群進(jìn)行分類[46]。用WBIA方法測定融合蛋白A1D3R1及各亞組分蛋白刺激產(chǎn)生的特異性IFN-γ水平。 4.亞單位疫苗A1D3R1/MTO的免疫原性分析：融合蛋白A1D3R1聯(lián)合新型佐劑MTO(主要包括海藻糖6,6’-二分枝菌酸和單磷酰脂質(zhì)A)構(gòu)建亞單位疫苗A1D3R1/MTO,并免疫小鼠；同時設(shè)置PBS陰性對照組、佐劑MTO組及BCG陽性對照組。免疫9周后進(jìn)行免疫學(xué)分析：收集血清并檢測血清中特異性抗體及其亞類滴度；無菌分離脾細(xì)胞,加入特異性抗原及對照,刺激后檢測培養(yǎng)上清中抗原特異性細(xì)胞因子,包括：IFN-γ、TNF-α及IL-2;收集脾細(xì)胞并刺激后,通過流式細(xì)胞術(shù)對脾臟不同類型淋巴細(xì)胞進(jìn)行分型。 5.亞單位疫苗A1D3R1/MTO免疫小鼠抗M.tb H37Rv的短期保護(hù)性評價：小鼠免疫9周后,用M.tb H37Rv毒株攻擊感染。每天監(jiān)測小鼠生存狀態(tài),以繪制幸存率曲線；4周后處死小鼠,分別檢測肺臟及脾臟中荷菌量；同時取左肺上葉部分組織進(jìn)行常規(guī)HE染色及Ziehl-Neelsen抗酸染色,并進(jìn)行組織病理學(xué)評價。 [結(jié)果] 1.成功構(gòu)建、表達(dá)并純化融合蛋白A1D3R1： 1)成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET30b-A1D3R1,并經(jīng)酶切鑒定及DNA凝膠電泳證實產(chǎn)物片段大小正確； 2)成功表達(dá)融合蛋白A1D3R1,純化過程經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳證實其表達(dá)及純化結(jié)果,通過Westem-blottig證實純化蛋白具有較高的純度及生物活性。 2.A1D3R1及亞組分蛋白能被中國M.tb感染人群T細(xì)胞識別并刺激產(chǎn)生高水平的IFN-γ:通過臨床指征初篩結(jié)合rCM-WBIA界定人群后: 1)融合蛋白A1D3R1及其亞組分蛋白均可被中國M.tb感染者的T細(xì)胞所識別； 2)總?cè)巳杭案腥救巳航?jīng)AlD3R1刺激后,均誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著高于亞組分蛋白Rv3407、PhoY2、Ag85A及Rv2626c的IFN-γ水平(P0.05)(RpfB除外)。 3.亞單位疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的Thl型免疫應(yīng)答： 1)亞單位疫苗免疫小鼠血清中產(chǎn)生高水平的A1D3R1特異性IgG抗體及其亞類,且趨向Thl型反應(yīng); 2)亞單位疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞分泌高水平的A1D3R1特異性細(xì)胞因子IFN-γ、 TNF-α和IL-2； 3)亞單位疫苗免疫小鼠脾細(xì)胞PPD或A1D3R1抗原特異性總IFN-γ+分泌型CD4+或CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著升高； 4)亞單位疫苗誘導(dǎo)脾細(xì)胞中PPD或A1D3R1特異性的IFN-γ+IL-2+分泌型CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著上升； 5)亞單位疫苗誘導(dǎo)脾細(xì)胞中PPD或A1D3R1特異性的IFN-γ+、IFN-γ+IL-2+以及IFN-γ+TNF-α+分泌型CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著上升。 4.亞單位疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生較好的抗結(jié)核保護(hù)效果：經(jīng)M.tb H37Rv攻毒4周后,A1D3R1/MTO組臟器荷菌量相對于PBS組和MTO組顯著下降(P0.05),但仍高于BCG組小鼠(P0.001)；病理切片鏡下觀,病理改變較PBS及MTO組明顯減輕；短期幸存率達(dá)到83.33%。 5.佐劑MTO免疫小鼠能產(chǎn)生一定水平的免疫保護(hù)性：MTO組小鼠脾細(xì)胞經(jīng)刺激后,能產(chǎn)生顯著高于PBS組的IFN-γ及TNF-α(P0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測證實MTO組小鼠經(jīng)刺激后主要產(chǎn)生顯著高于PBS組的IFN-γ+單陽的分泌型T細(xì)胞,以及IFN-y+IL-2+雙陽的分泌型CD4+T細(xì)胞(P0.05);抗結(jié)核病保護(hù)效應(yīng)優(yōu)于PBS組,且短期幸存率達(dá)到83.33%。 [結(jié)論] 本研究所構(gòu)建亞單位疫苗A1D3R1/MTO經(jīng)動物模型證實具有抗結(jié)核分枝桿菌急性感染的免疫保護(hù)性,其免疫保護(hù)性可能與特異性CD4+Th1型應(yīng)答相關(guān)；進(jìn)一步分析證實主要誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IFN-y+IL-2+雙陽的分泌型CD4+T細(xì)胞,以及IFN-γ+、 IFN-γ+IL-2+;和IFN-y+TNF-a+雙陽的分泌型CD8+T細(xì)胞。同時,也證實我們發(fā)明的MTO佐劑,能夠誘導(dǎo)以分泌IFN-γ和TNF-α為主的Th1型免疫應(yīng)答,為進(jìn)一步用于疫苗研究評價奠定了基礎(chǔ)。 【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

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本文編號：2712306