【摘要】：本研究通過優(yōu)化小鼠白介素24(mIL-24)基因序列,構(gòu)建以Fc-tag為標(biāo)簽的mIL-24-Fc融合蛋白.對(duì)CHO進(jìn)行MTX分級(jí)加壓篩選,獲得了穩(wěn)定、高表達(dá)mIL-24-Fc蛋白的陽性克隆,同時(shí)優(yōu)化了CHO細(xì)胞無血清馴化與穩(wěn)定表達(dá)蛋白體系.經(jīng)protein A親和層析純化mIL-24-Fc蛋白并利用AP binding實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生物學(xué)活性后,小鼠皮內(nèi)注射mIL-24-Fc蛋白和傷口愈合實(shí)驗(yàn)證明:注射mIL-24-Fc蛋白后,小鼠表皮產(chǎn)生2~3層細(xì)胞增生,傷口愈合速度加快.
【圖文】：

石蠟包埋獲得小鼠背皮切片，通過ＨＥ染色后觀察小鼠背部組織．３結(jié)果３．１ｍＩＬ－２４－Ｆｃ重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定優(yōu)化后的ｍＩＬ－２４基因約為７００ｂｐ，將基因合成后得到的ｐＵＣ５７－ｍＩＬ－２４質(zhì)粒，用ｈｉｎｄⅢ和ＢｇｌⅡ限制內(nèi)切酶雙酶切連接到Ｆｃ－Ｔａｇ載體上（圖１Ａ）．其測(cè)序結(jié)果與插入基因序列完全一致，同時(shí)用Ｆｃ－Ｔａｇ載體上特異性引物Ｌ－ＡＰ和Ｒ－Ｆｃ進(jìn)行質(zhì)粒ＰＣＲ鑒定（圖１Ｂ），得到相當(dāng)大小的ＰＣＲ產(chǎn)物．圖１ｍＩＬ－２４－Ｆｃ質(zhì)粒的構(gòu)建（Ａ）ｍＩＬ－２４－Ｆｃ質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖；（Ｂ）ｍＩＬ－２４－Ｆｃ重組質(zhì)粒ＰＣＲ鑒定結(jié)果．目的條帶大小約為７００ｂｐ．Ｆｉｇ．１ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｍＩＬ－２４－ＦｃＰｌａｓｍｉｄ（Ａ）ｐｌａｓｍｉｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｉａｇｒａｍｏｆｍＩＬ－２４－Ｆｃ．（Ｂ）ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｏｆｍＩＬ－２４－Ｆｃ．Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓｔｒａｐｓｉｚｅｉｓ７００ｂｐ．３．２ｍＩＬ－２４－Ｆｃ蛋白純化ｍＩＬ－２４蛋白的Ｃ端融合了Ｆｃ－Ｔａｇ，因此ｍＩｌ－２４－Ｆｃ蛋白樣品可以通過ｐｒｏｔｅｉｎＡ親和層析柱進(jìn)行親和層析，再將純化蛋白超濾至ＰＢＳ緩沖液中保存，再用１０％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝膠電泳分離純化前的樣品、穿透液中的樣品和純化后的樣品，考馬斯亮藍(lán)染色分析結(jié)果表明，，原液中的雜蛋白經(jīng)ｐｒｏｔｅｉｎＡ親和層析柱純化后得到高純度的洗脫回收液，同時(shí)穿透液中未見目的蛋白，說明目的蛋白均掛上了層析柱（圖２）．３．３ＡＰｂｉｎｄｉｎｇ

等量ＰＢＳ，從Ｄａｙ０開始拍照觀察直至ｄａｙ９．圖５表明，Ｄａｙ３開始，ＰＢＳ組和實(shí)驗(yàn)組傷口均縮合，ＰＢＳ組伴有出血但實(shí)驗(yàn)組已止血．Ｄａｙ５開始ＰＢＳ結(jié)痂，而實(shí)驗(yàn)組痂已退去表皮恢復(fù)平整．Ｄａｙ９開始實(shí)驗(yàn)組傷口已變小，而實(shí)驗(yàn)組還是痂期．４討論銀屑病的主要病理改變是表皮增生，角質(zhì)化和真皮炎細(xì)胞浸潤(rùn)．白介素１０家族在銀屑病中的地位暗示了白介素２４研究的可觀性．ｍＩＬ－２４在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為包涵體，變性復(fù)性困難，本實(shí)驗(yàn)圖４ｍＩＬ－２４－Ｆｃ實(shí)驗(yàn)小鼠背皮ＨＥ染色．分別于２０×和４０×物鏡下觀察結(jié)果Ｆｉｇ．４ＨＥＳｔａｉｎｉｎｇｏｆＭｏｕｓｅＳｋｉｎ．Ｖｉｅｗｅｄｕｎｄｅｒ２０×ａｎｄ４０×ｌｅｎｓ４３９

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本文編號(hào)：2712004