【摘要】：鈣離子在細胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)膜之間的流動對神經(jīng)元的基礎(chǔ)功能發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為胞內(nèi)重要的鈣儲存細胞器,參與調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣平衡,調(diào)控各種信號通路,介導(dǎo)細胞蛋白合成、信號傳導(dǎo)等過程。本實驗以小鼠胚胎干(embryonic stem, ES)細胞體外定向分化神經(jīng)元為模型,模擬胚胎神經(jīng)發(fā)育過程,考察若干鈣調(diào)控蛋白在小鼠ES細胞衍生神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存及神經(jīng)發(fā)生中的作用。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣離子動態(tài)平衡過程由蘭尼堿受體(ryanodine receptors, RyRs)、IP3受體(inositol 1,4,5-triphosphate receptors, IP3Rs)以及肌(內(nèi))質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)協(xié)調(diào)運作控制。其中,SERCA蛋白能量依賴性的鈣回調(diào)作用對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣平衡至關(guān)重要。本實驗考察了ES細胞神經(jīng)元分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存及鈣釋放特征,并探索SERCA在神經(jīng)元功能性發(fā)育中潛在作用及可能的分子機制。 Junctophilins (JPs)是一類被證實存在于興奮期細胞中的Ca2+平衡調(diào)控蛋白,神經(jīng)細胞表達Junctophilin 3 (JP-3), Junctophilin 4 (JP-4)兩種亞型。Jp-3,Jp-4基因敲除小鼠特征性表現(xiàn)出運動協(xié)調(diào)功能失常、平衡能力損傷并伴有記憶損傷。本研究利用ES細胞體外分化為神經(jīng)元模型,探索Jp-3,Jp-4在胚胎神經(jīng)發(fā)育過程中的作用。 第一章SERCA在小鼠ES細胞衍生神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存以及神經(jīng)突起發(fā)育中的作用 目的：探索小鼠胚胎干細胞神經(jīng)分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存及鈣釋放特征,并探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵蛋白SERCA在神經(jīng)元功能性發(fā)育中潛在的作用。 方法：采用經(jīng)典的4-/4+法誘導(dǎo)小鼠ES細胞定向分化為神經(jīng)元,10-7mol/L全反式維甲酸(Retinoic acid, RA)為陽性對照,0.1%二甲基亞砜(DMSO)為溶劑對照。在分化培養(yǎng)終點(貼壁鋪展培養(yǎng)d 8+10),光鏡和免疫熒光成像法鑒定神經(jīng)元形成(軸突長度是胞體長度的3倍及以上),細胞微管蛋白(p-tubulinⅢ)陽性。分別收集ES細胞、擬胚體(embryoid bodies, EBs)、貼壁培養(yǎng)d 8+0、d 8+5和d 8+10細胞樣本,以RT-PCR及Western-blot法,評價內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)鈣調(diào)控蛋白RyRs. IP3受體及SERCA在各個神經(jīng)分化時期表達特征。以神經(jīng)前體細胞標志蛋白(nestin),成熟神經(jīng)元標志蛋白(p-tubulinlll),神經(jīng)軸突標志蛋白(neurofilaments, NEFM)和神經(jīng)樹突標志蛋白(microtubule-associated protein 2, MAP2)表達評價分化情況；FM1-43熒光染色觀察分化成熟神經(jīng)元囊泡攝取功能。選取分化早期d 8+3神經(jīng)前體細胞及d 8+10分化成熟神經(jīng)元,經(jīng)由活細胞工作站檢測其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放功能。以10-6mol/L SERCA抑制劑(cyclopiazonic acid, CPA)論證SERCA對神經(jīng)分化的特定作用。觀察CPA是否影響RA促神經(jīng)分化作用及神經(jīng)元囊泡攝取功能。同時利用Western-blot法檢測MAPK通路中ERK, JNK, p38磷酸化等相關(guān)分子事件的變化,以探索RA促神經(jīng)分化過程SERCA的可能機制。 結(jié)果：小鼠ES細胞定向分化神經(jīng)元過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣相關(guān)蛋白SERCA、RyRs和IP3Rs表達均隨分化時相依賴性上調(diào)。神經(jīng)前體細胞即具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放功能,成熟神經(jīng)元中此功能進一步增強。SERCA抑制劑CPA能顯著減少RA促ES細胞分化為神經(jīng)細胞,抑制神經(jīng)元軸突和樹突發(fā)育,并抑制神經(jīng)元囊泡攝取功能。提示SERCA具有調(diào)控神經(jīng)分化作用,特別體現(xiàn)在促軸突和樹突發(fā)育以及囊泡攝取功能。CPA可下調(diào)MAPK通路中ERK, JNK和p38的磷酸化,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存對神經(jīng)分化調(diào)節(jié)作用尚伴隨MAPK家族蛋白的激活。 結(jié)論：RA促小鼠ES細胞定向分化神經(jīng)過程,呈現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存及釋放功能,該功能存在于神經(jīng)細胞分化早期,且隨分化進程呈上調(diào)趨勢。抑制SERCA鈣離子泵功能,不僅降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣儲存,尚呈現(xiàn)抑制神經(jīng)分化作用,特別是影響軸突和樹突發(fā)育,并抑制了神經(jīng)囊泡攝取功能。神經(jīng)分化過程中SERCA活性伴有MAPK家族蛋白磷酸化參與。 第二章Jp-3,Jp-4基因?qū)π∈驟S細胞衍生神經(jīng)元胚層發(fā)育、線粒體表達及神經(jīng)遞質(zhì)分泌的影響 目的：探索ES細胞衍生神經(jīng)元Ca2+平衡調(diào)控蛋白基因(Junctophilin 3, Junctophilin 4, Jp-3, Jp-4),在神經(jīng)分化中的作用,及其與神經(jīng)元線粒體功能和神經(jīng)遞質(zhì)分泌功能的關(guān)系。 方法：小鼠ES細胞神經(jīng)分化早期,小干擾Jp-3,Jp-4(siRNA),收集鋪展分化培養(yǎng)d 8+0、d 8+2、d 8+6、d 8+8各時期細胞樣本,RT-PCR法考察分化相關(guān)基因OCT3/4(未分化ES細胞標志基因)、Fg35(外胚層發(fā)育標志基因)、Brachy(中胚層發(fā)育標志基因)、AFP(內(nèi)胚層發(fā)育標志基因)、nestin(神經(jīng)前體細胞標志基因)的表達。貼壁培養(yǎng)d 8+0、d 8+5、d 8+10(神經(jīng)分化終點)各時期,評價線粒體融合蛋白基因Mfn1、Mfn2,過氧化物酶增殖激活受體輔酶激活因子PGC1-α及核呼吸因子NRF-1的表達特征。MitoTracker* Red標記活細胞線粒體,細胞免疫化學(xué)檢測siJp-3, Jp-4神經(jīng)元線粒體完整性。RT-PCR法檢測神經(jīng)細胞分化終點相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)標志性蛋白泡狀谷氨酸鹽轉(zhuǎn)運體(vesicular glutamate transporters, VGluTl),谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase 65, GAD65),乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)基因表達。 結(jié)果：siJp-3, siJp-4可顯著降低外胚層Fgf5轉(zhuǎn)錄,部分減少神經(jīng)前體細胞nestin轉(zhuǎn)錄,對其他胚層相關(guān)基因表達則影響不明顯。siJp-3, siJp-4尚可損傷線粒體完整性,表現(xiàn)為線粒體熒光強度降低,且在軸突和樹突內(nèi)分布減少。siJp-3, siJp-4抑制了線粒體結(jié)構(gòu)與功能基因Mfn1、Mfn2、PGC1-a及NRF-1的轉(zhuǎn)錄。同時,siJp-3, Jp-4也可抑制分化終點成熟神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)標志性蛋白VGluTl、GAD65、AchE的基因表達,提示Jp-3,Jp-4缺失可導(dǎo)致相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)合成降低。 結(jié)論：小鼠ES細胞神經(jīng)分化過程中,Ca2+平衡調(diào)控蛋白基因Jp-3,Jp-4正常表達與神經(jīng)分化、線粒體功能及神經(jīng)遞質(zhì)的分泌呈密切相關(guān)性。
【圖文】：

圖1.4小鼠ES細胞衍生神經(jīng)元表達SERCAZb貼壁ds+lo天細胞進行免疫熒光檢測，sEReAZb(紅色)，p一tubu一in111標記神經(jīng)元(綠色)，DAPI標記細胞核(藍色)。Bar=25協(xié)m。Fig1.4ImmunocytoehemiealstainingofESeell·derivedneurons(coloealizationwithSERCAZb).L3.2.2小鼠Es細胞神經(jīng)元定向分化過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道相關(guān)受體基因表達為檢測Es細胞定向分化神經(jīng)元過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣受體相關(guān)基因表達的變化，本實驗采用Rl’-pcR法對凡五、、IP了R、sERcAZb進行檢測。結(jié)果顯示(圖1.5)，，凡五S從ds+0天開始表達，IP了R表達始于EB期，SERCAZb則從ES期就有表達。這些ca2+受體基因在Es細胞定向發(fā)育為神經(jīng)元過程中均呈穩(wěn)定表達。

為檢測ES細胞定向分化神經(jīng)元過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣受體相關(guān)蛋白表達的變化，實驗采用 westemblot法檢測助Rs，IP3R，sERcAZb蛋白表達情況。結(jié)果顯示(圖1.6):RyRs從ds+o天開始表達，IP3R表達始于EB期，sEReAZb則從Es期就有表達。與PcR結(jié)果相一致。這些c擴+受體蛋白在Es細胞定向發(fā)育為神經(jīng)元過程中表達呈一定上調(diào)趨勢。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【引證文獻】

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1 劉泉;24小時內(nèi)MDMA對大鼠腦組織氧化應(yīng)激、凋亡相關(guān)蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca~(2+)通道的影響[D];華中科技大學(xué);2013年

本文編號：2711874