【摘要】：本課題研究包括兩部分內(nèi)容,第一部分為:TTF-1啟動子調(diào)控mi R-7真核表達載體納米脂質(zhì)體的制備;第二部分為:納米脂質(zhì)體遞送TTF-1啟動子調(diào)控mi R-7真核表達載體對人肺癌模型腫瘤體內(nèi)生長的影響。分述如下:目的:第一部分:構(gòu)建TTF-1啟動子調(diào)控miR-7真核表達載體,并用薄膜分散法制備miR-7真核表達載體納米脂質(zhì)體。第二部分:常規(guī)建立人肺癌裸鼠模型,使用HE染色、實時熒光定量PCR、Western Blot、免疫熒光(Ki-67、TUNEL)等實驗方法觀察納米脂質(zhì)體遞送TTF-1啟動子調(diào)控miR-7真核表達載體對人肺癌裸鼠模型腫瘤生長的影響;同時初步評估其體內(nèi)安全性。方法:第一部分:利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建TTF-1啟動子調(diào)控miR-7真核表達載體;使用薄膜分散法制備包裹miR-7真核表達載體的納米脂質(zhì)體;利用透射電鏡、激光粒度及Zeta電位分析儀檢測其外觀、粒徑、zeta電位、多分散指數(shù)PDI,利用透析法檢測其包封率和穩(wěn)定性。第二部分:使用人肺癌95D細胞建立人肺癌裸鼠模型(每組各6只);模型建立成功后分別通過裸鼠尾靜脈注射包裹100μg p-T-miR-7真核表達載體的納米脂質(zhì)體和包裹100μg p-T載體的納米脂質(zhì)體,隨后每3天注射一次,并于每次注射前測量計算腫瘤體積,動態(tài)監(jiān)測模型小鼠腫瘤體積變化,連續(xù)注射3次,且于末次注射3天后將小鼠麻醉處死;分別取p-T-miR-7納米脂質(zhì)體組和p-T納米脂質(zhì)體組的腫瘤組織和肺臟組織,HE染色觀察組織病理學(xué)改變;Real-time PCR和熒光共聚焦技術(shù)檢測p-T-miR-7載體在腫瘤組織的表達情況,以及兩組小鼠腫瘤組織中腫瘤生長相關(guān)因子CDK2、CDK3、CDK4和CDK6和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、E-cadherin和CXCR4的表達變化;隨后觀察兩組腫瘤組織中增殖核抗原Ki-67的表達情況,以及TUNEL法觀察兩組腫瘤組織中腫瘤細胞的凋亡水平;Western blot檢測信號通路p-Akt,p-Erk以及靶分子NDUFA-4的表達變化;分析荷瘤小鼠主要臟器的HE染色、臟器重量、臟器指數(shù)和血糖、血脂等生化指標變化,并用實時熒光定量PCR檢測小鼠主要臟器的mi R-7表達水平和p-T-miR-7載體質(zhì)粒拷貝數(shù)分布情況以初步評估p-T-miR-7納米脂質(zhì)體體內(nèi)治療的安全性。結(jié)果:第一部分:首先分別成功構(gòu)建TTF-1啟動子調(diào)控miR-7真核表達載體(pEGFP-N1-TTF-1-miR-7,命名為p-T-miR-7)和TTF-1啟動子真核表達載體(pEGFP-N1-TTF-1,命名為p-T)。隨后使用薄膜分散法分別制備包裹p-T-miR-7載體的p-T-miR-7納米脂質(zhì)體和包裹p-T載體的p-T納米脂質(zhì)體。利用透射電鏡、激光粒度及Zeta電位分析儀分別檢測其外觀、粒徑、zeta電位、多分散指數(shù)PDI,結(jié)果顯示:兩種納米脂質(zhì)體外觀呈球形或近球形;p-T-miR-7納米脂質(zhì)體平均粒徑為72.15 nm、zeta電位為-3.15mV、PDI指數(shù)為0.258,p-T納米脂質(zhì)體平均粒徑為78.10 nm、zeta電位為-18.88mV、PDI指數(shù)為0.255;使用透析法檢測其包封率,結(jié)果顯示:p-T-miR-7納米脂質(zhì)體包封率為67%、p-T納米脂質(zhì)體包封率為64%,且包封率穩(wěn)定。第二部分:觀察人肺癌裸鼠荷瘤模型腫瘤動態(tài)生長情況,統(tǒng)計分析腫瘤體積變化,結(jié)果顯示:p-T-miR-7納米脂質(zhì)體實驗組相比于p-T納米脂質(zhì)體對照組,腫瘤生長速度明顯減緩(P0.05);對人肺癌裸鼠荷瘤模型肺臟組織和腫瘤組織做石蠟切片HE染色觀察可見:肺臟組織中相比于p-T對照組鏡下觀察到明顯肺轉(zhuǎn)移,p-T-miR-7實驗組則無明顯肺轉(zhuǎn)移灶;腫瘤組織中相比于p-T對照組,p-T-miR-7實驗組鏡下可見大面積腫瘤壞死區(qū)域;Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn):相比于p-T對照組,p-T-miR-7實驗組中miR-7的表達水平明顯升高(P0.01);熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)p-T-miR-7組腫瘤組織中有大量EGFP蛋白表達;同時,p-T-miR-7實驗組腫瘤組織中腫瘤生長相關(guān)因子CDK2、CDK3、CDK4和CDK6以及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、E-cadherin、CXCR4的表達均顯著降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);相比于p-T對照組,p-T-miR-7實驗組腫瘤組織中增殖核抗原Ki-67表達水平明顯降低(P0.05),TUNEL法則顯示:相比于p-T對照組,p-T-miR-7實驗組腫瘤組織中細胞凋亡明顯增加;Western blot檢測腫瘤組織中信號通路變化發(fā)現(xiàn):相比于p-T對照組,p-T-miR-7實驗組的p-Akt、p-Erk以及靶分子NDUFA-4蛋白表達水平明顯下調(diào),具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);對納米脂質(zhì)體遞送TTF-1啟動子調(diào)控miR-7真核表達載體在體內(nèi)的分布和安全性檢測結(jié)果顯示:p-T-mi R-7實驗組與p-T對照組相比,小鼠主要臟器:心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦組織、小腸、淋巴結(jié)的形態(tài)學(xué)與病理生理學(xué)均無明顯差異,且臟器重量和臟器指數(shù)也無明顯差異(P0.05);同時,兩組小鼠相關(guān)生化指標TC、TG、GLU、AST和ALT均無明顯差異(P0.05);最后,小鼠主要臟器中肺臟p-T-miR-7質(zhì)�？截悢�(shù)分布水平明顯高于其他臟器,提示納米脂質(zhì)體可在肺臟中富集。結(jié)論:第一部分:利用薄膜分散法成功制備TTF-1啟動子調(diào)控miR-7真核表達載體的納米脂質(zhì)體;第二部分:納米脂質(zhì)體遞送TTF-1啟動子調(diào)控miR-7真核表達載體可顯著抑制人肺癌裸鼠模型腫瘤的生長。
【圖文】：

zeta 電位分別為-3.15 mV 和-18.88 mV（如圖1-3 所示）。圖 1-3 納米脂質(zhì)體 Zeta 電位Fig.1-3 The zeta potential of nanoliposomes.Weighted all samples (Soya lecithin : cholesterol = 4:1, mass ratio) into an eggplant-flask, added 6 mLchloroform. Solution was concentrated under reduced pressure to remove all chloroform. After that, 3 mL PBS（Contained P-T or P-T-miR-7）were added and eluted with glass balls until the nanoliposomes separated fromeggplant-flask completely. Finally, nanoliposomes was obtained after sonication for 50 minutes. The zeta potentialof P-T nanoliposome and P-T-miR-7 nanoliposomes.3.2.3 納米脂質(zhì)體包封率分別利用透析法測定最優(yōu)化條件制備的 P-T-miR-7 納米脂質(zhì)體和 P-T 納米脂質(zhì)體包封率，檢測發(fā)現(xiàn)：P-T-miR-7 納米脂質(zhì)體包封率為 67%，，P-T 納米脂質(zhì)體

納米脂質(zhì)體包封率 The entrapment efficiency of nanoliposomes.d all samples (Soya lecithin : cholesterol = 4:1, mass ratio) into an eggplant-flaskrm. Solution was concentrated under reduced pressure to remove all chloroform. Afterined P-T or P-T-miR-7）were added and eluted with glass balls until the nanoliposome-flask completely. Finally, nanoliposomes was obtained after sonication for 50 minutesy of nanoliposomes was detected by dialysis method.米脂質(zhì)體穩(wěn)定性別于制備后不同時間點，即 0 天、14 天、28 天、60 天，利用條件制備的 P-T-miR-7 納米脂質(zhì)體和 P-T 納米脂質(zhì)體包封率，-T-miR-7 納米脂質(zhì)體還是 P-T 納米脂質(zhì)體均具有良好穩(wěn)定性（
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R734.2;R-332

【參考文獻】

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1 趙娟娟;陶弋婧;郭萌萌;秦娜琳;鄭靜;田丹;徐林;;微RNA-7與腫瘤關(guān)系的研究進展[J];腫瘤;2014年05期

2 胡燕;廖珍媛;陳超;秦娜琳;鄭靜;田丹;李永菊;朱順飛;羅軍敏;徐林;;過表達microRNA-7通過下調(diào)CGG結(jié)合蛋白1的表達抑制人肺癌細胞生長[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;2014年02期

3 Ming Gao;Hao Yin;Zhe-Wei Fei;;Clinical application of microRNA in gastric cancer in Eastern Asian area[J];World Journal of Gastroenterology;2013年13期

4 宋永祥;李穎;秦安東;廖珍媛;李永菊;羅軍敏;任濤;徐林;;miRNA-7真核表達載體的構(gòu)建與鑒定[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年04期

5 鄭靜;李穎;秦安東;秦娜琳;羅軍敏;徐林;;miRNA-7在小鼠不同組織器官中表達的檢測及其意義[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2012年02期

6 錢靜;劉榮花;劉小明;姜佩;鄭一誡;儲以微;高海峰;;MicroRNA-7對非小細胞肺癌表柔比星化療的增敏作用[J];中國腫瘤生物治療雜志;2012年02期

7 Jeffrey Liu;;microRNAs, an active and versatile group in cancers[J];International Journal of Oral Science;2011年04期

8 徐林;任濤;秦安東;周涯;羅軍敏;姚新生;李穎;;microRNA-7對人肺癌95D細胞體外侵襲的作用[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年01期

9 鄧啟盼;曹亞;;納米脂質(zhì)體應(yīng)用于腫瘤研究的進展[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2010年06期

10 徐林;任濤;周涯;秦安東;鄭靜;;微小RNA-7對人肺癌95D細胞體外增殖的作用[J];腫瘤;2010年09期

本文編號：2711766