本文關(guān)鍵詞：脊髓背角iNOS過表達(dá)在帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛大鼠模型中的表達(dá)及意義，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的疼痛是人類對疾病最難以忍受和最痛苦的體驗(yàn)之一,尤其像帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(PHN),主要表現(xiàn)為受損皮區(qū)痛覺過敏和異常疼痛,病程較長,遷延不愈,持續(xù)約3個(gè)月以上。其患病群體主要以老年人為主,而我國正在步入老齡化社會,帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛將嚴(yán)重威脅著老年人的健康。在臨床上,應(yīng)用抗病毒藥物、抗抑郁藥物、針灸以及中醫(yī)中藥進(jìn)行治療效果均不如意,目前還沒一種行之有效的方法對其進(jìn)行預(yù)防和治療。PHN屬于一種特殊的神經(jīng)病理性痛,其發(fā)病機(jī)理目前并未搞清楚。經(jīng)典觀點(diǎn)認(rèn)為,帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(PHN)可能是由外周神經(jīng)和末梢的炎癥和變性引起的,近年來越來越多的觀點(diǎn)認(rèn)為其與中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有莫大的聯(lián)系[1]。脊髓背角是痛覺傳導(dǎo)通路的第二級神經(jīng)元所在部位,是痛覺調(diào)控的關(guān)鍵部位。本實(shí)驗(yàn)就是以脊髓背角為切入點(diǎn),從脊髓水平來探索和研究PHN的病理機(jī)制。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)在大鼠痛覺過敏和異常疼痛形成的時(shí)間段,脊髓背角誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的活性和蛋白表達(dá)水平也相應(yīng)地顯著升高。那么,我們推測:①iNOS可能與PHN存在密切聯(lián)系;②它在PHN痛覺過敏和異常疼痛的形成過程中發(fā)揮著重要作用;③應(yīng)用iNOS的抑制劑或清除劑后,應(yīng)該能達(dá)到鎮(zhèn)痛效果;④它對臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。為了驗(yàn)證這些推測,我們設(shè)計(jì)了本試驗(yàn)。方法⑴建立帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛大鼠模型:將大鼠隨機(jī)分為三組,分別為vzv接種組,假接種組和陰性對照組(n=10/組)。將水痘-帶狀皰疹病毒(vzv)感染cv-1細(xì)胞,再用磷酸鹽緩沖液收集大約有80%被感染的cv-1細(xì)胞制成接種溶液。制成的接種溶液接種于sd大鼠雙側(cè)后足趾皮下,作為vzv病毒接種組。接種不含vzv病毒的接種液的大鼠作為假接種組(mock組),接種生理鹽水的作為對照組(naive組)。vzv組隨后形成痛覺過敏和異常疼痛,且經(jīng)抗病毒藥物治療,觀察其痛覺閾值是否發(fā)生改變。⑵形態(tài)學(xué)檢測:10%水合氯醛麻醉大鼠,經(jīng)4%多聚甲醛灌注成功,仔細(xì)取大鼠脊髓腰4-6節(jié)段,然后分別用20%蔗糖、30%蔗糖脫水,4℃過夜。包埋固定,恒冷機(jī)切片機(jī)進(jìn)行切片。用兔抗inosigg,兔抗nnosigg或兔抗enosigg進(jìn)行免疫組化染色。再用免疫熒光雙標(biāo)染色。顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察脊髓背角變化,與對照組比較。獲取數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑶westernblot檢測:麻醉大鼠,在冰上快速取出大鼠脊髓背角組織,裂解并提取總蛋白,進(jìn)行蛋白定量,電泳,轉(zhuǎn)膜,分別以抗inos,nnos或enos的一抗4℃孵育過夜。加入二抗,發(fā)光,分析蛋白表達(dá)的相對量參數(shù),并與內(nèi)參β-actin比較,以矯正蛋白定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差,比較各組蛋白樣品之間的表達(dá)差異。獲取數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。⑷鞘內(nèi)置管給藥:對vzv組大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管術(shù)。置管成功后,當(dāng)大鼠機(jī)械痛覺閾值降至最低時(shí),我們經(jīng)鞘內(nèi)應(yīng)用ptio(no清除劑,30μg),l-name(nos廣譜抑制劑,50μg),l-nil(inos抑制劑,100μg),7-nina(nnos抑制劑,45μg)或l-nio(enos抑制劑,25μg)[2],對照組給予對應(yīng)量的生理鹽水,觀察鎮(zhèn)痛效果。于給藥后0、10、20、30、40、50、60分鐘檢測其痛覺閾值變化,記錄數(shù)值,統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果⑴vzv組在接種病毒溶液后第5天,機(jī)械痛覺閾值開始下降(11.4±1.6g),約兩周閾值降到最低點(diǎn)(5.8±1.4g),持續(xù)至第8周逐漸恢復(fù),12周左右接近正常(25.4±3.6.6g)。與假接種組和陰性對照組相比較,(p0.05)。受損皮區(qū)也沒有皮疹,與臨床phn患者臨床表現(xiàn)相似。建成phn模型后,進(jìn)行系統(tǒng)抗病毒藥物治療,phn大鼠機(jī)械痛覺閾值在給藥前后未發(fā)生明顯變化,這與臨床上對phn患者進(jìn)行抗病毒效果一致。⑵大鼠形成痛覺過敏和異常疼痛相應(yīng)的時(shí)間段,對切片進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn),與對照組相比,inos在vzv組大鼠脊髓背角的染色密度明顯增加,并且其免疫陽性結(jié)構(gòu)也主要聚集在脊髓背角的i和ii層。再進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色可以看出,脊髓背角inos免疫陽性結(jié)構(gòu)有且僅表現(xiàn)在膠質(zhì)原纖維酸性蛋白gfap標(biāo)記的免疫陽性細(xì)胞(可能為膠質(zhì)細(xì)胞)。而ox42或neun標(biāo)記的免疫陽性細(xì)胞并無inos免疫陽性結(jié)構(gòu)。⑶westernblot檢測顯示,vzv組大鼠在病毒接種后第五天左右,脊髓背角inos的蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)了明顯增加(0.21±0.08)。在接種后兩周inos的蛋白表達(dá)升到顛峰(0.68±0.13),這種狀態(tài)將維持著,相應(yīng)情況下naive組(0.06±0.02)和mock組(0.05±0.01)(n=10/組;p0.05)。由此可見,vzv組大鼠痛覺閾值的變化與inos的活性表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(p0.001,r= 0.89)[1]。與對照組相比,vzv組脊髓背角nnos或enos的蛋白表達(dá)水平在痛覺過敏或異常疼痛形成前后幾乎無變化。⑷phn大鼠模型痛覺過敏和異常疼痛最明顯的時(shí)刻,經(jīng)鞘內(nèi)給予ptio(no清除劑,30μg),l-name(nos廣譜抑制劑,50μg),l-nil(inos抑制劑,100μg),均能達(dá)到鎮(zhèn)痛效果。而鞘內(nèi)給予其它抑制劑對于痛覺閾值并沒發(fā)生改變。(n=10/組)結(jié)論:⑴phn不是簡單地由皰疹病毒的急性復(fù)制所形成的。帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛是一種特殊的神經(jīng)病理性痛,屬于慢性痛,雖然由水痘帶狀皰疹病毒感染引起,但是它的發(fā)病機(jī)制不是簡單地由病毒的急性復(fù)制所形成。在實(shí)驗(yàn)中,大鼠皮膚未起皮疹,給予抗病毒治療不能使疼痛緩解也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。⑵nos對疼痛的調(diào)控主要集中在脊髓背角的i和ii層。位于痛覺傳導(dǎo)通路的第二級神經(jīng)元所在處的正是脊髓背角,其最外層為i層或著稱為邊緣層。i層中大多數(shù)神經(jīng)元屬于特異性疼痛神經(jīng)元,接受來自皮膚和內(nèi)臟痛覺信號的aδ纖維;緊靠邊緣層為ii層或膠狀質(zhì),接受c纖維傳入。nos就是在這完成對疼痛的調(diào)控。⑶nos的表達(dá)變化和痛覺閾值的高低呈顯著的負(fù)相關(guān)。inos的啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)能與nf-κb結(jié)合,激活nos,nos的活性升高,產(chǎn)生過量的no,間接地激活c-fos(fos也主要存在于脊髓背角i和ii層)引起廣泛的生物學(xué)效應(yīng),介導(dǎo)了突觸可塑性改變和中樞敏化形成痛覺過敏,phn大鼠的痛覺閾值降低了。⑷phn中起調(diào)控作用的是inos而不是nnos或者enos。在鞘內(nèi)應(yīng)用誘導(dǎo)型一氧化氮合酶inos清除劑或抑制劑,模型大鼠的機(jī)械痛覺閾值逐漸恢復(fù)至正常水平;在經(jīng)鞘內(nèi)應(yīng)用內(nèi)皮型eNOS或神經(jīng)元型一氧化氮合酶nNOS清除劑或抑制劑,模型大鼠的機(jī)械痛覺閾值并未發(fā)生多大改變。這說明大鼠脊髓背角iNOS的表達(dá)活性(而不是nNOS或eNOS)與帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛即PHN的機(jī)械痛覺閾值變化之間可能存在一定的因果關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶iNOS參與并在PHN痛覺過敏和異常疼痛的形成過程中扮演了重要角色。這加深了我們對PHN病理發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)知,對于預(yù)防和治療帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛提供新的更為合理的理論補(bǔ)充。臨床上在開發(fā)新一代的鎮(zhèn)痛藥物方面具有實(shí)際意義[1]。這無疑對臨床患者來說是個(gè)好消息。
【關(guān)鍵詞】：疼痛 帶狀皰疹 脊髓背角 一氧化氮 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R752.12;R-332
【目錄】：

• 縮略語表4-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-17
• 前言17-18
• 文獻(xiàn)回顧18-28
• 實(shí)驗(yàn)一 帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛大鼠模型的建立28-37
• 1 材料28-29
• 2 方法29-33
• 3 結(jié)果33-35
• 4 討論35-37
• 實(shí)驗(yàn)二 PHN狀態(tài)下i NOS在脊髓背角的表達(dá)37-57
• 1 材料37-39
• 2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法39-48
• 3 結(jié)果48-52
• 4 討論52-57
• 實(shí)驗(yàn)小結(jié)57-58
• References58-62
• 個(gè)人簡歷及研究成果62-63
• 致謝63

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳同度,張昌穎;素食大鼠的貧血現(xiàn)象[J];營養(yǎng)學(xué)報(bào);1957年04期

2 陳偉強(qiáng);趙善廣;;自制注射用大鼠固定裝置[J];上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);1992年04期

3 肖柳英,林培英,馮昭明,張丹;不同周齡的SD大鼠生理、生化及體重的正常值測定[J];中藥新藥與臨床藥理;1996年03期

4 李淑云;簡易大鼠灌胃器的制作[J];錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年04期

5 楊明智,陳積圣;一種大鼠抓取與固定的新工具介紹[J];上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);2001年03期

6 戴英,陸群;復(fù)方H_(505)對Wistar大鼠外周血的血液流變學(xué)指標(biāo)的影響[J];中國血液流變學(xué)雜志;2001年01期

7 韋應(yīng)波,孫喜慶,曹新生,姚永杰,馮岱雅,楊長斌;+Gz暴露時(shí)間對大鼠記憶功能和行為的影響[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;2003年01期

8 呂學(xué)軍,郭俊生,李敏,周利梅,張永娟;暈船大鼠體內(nèi)鐵含量的變化[J];中國職業(yè)醫(yī)學(xué);2003年04期

9 湯仁仙,王迎偉,王慧,周峰;201A中藥合劑對大鼠抗腎小球基底膜腎炎病變的影響[J];徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年06期

10 孫同柱,付小兵,翁立新,梁雪梅,陳偉;介紹一種簡易的大鼠保定方法[J];上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué);2004年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 尹音;孫振宇;胡敏;李冬霞;;持續(xù)性高正加速度對大鼠顳頜關(guān)節(jié)損傷的作用[A];第八屆全國顳下頜關(guān)節(jié)病學(xué)及（牙合）學(xué)大會論文匯編[C];2011年

2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;

本文編號：270972