【摘要】：胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ESCs)具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。無論在體外還是體內(nèi)環(huán)境,胚胎干細(xì)胞都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。處于MⅡ期卵母細(xì)胞在某些理化因素的刺激下,不經(jīng)過精子受精作用,在保持二倍體狀態(tài)下發(fā)生有絲分裂獲得的早期胚胎發(fā)育過程稱為孤雌激活。卵母細(xì)胞孤雌激活后獲得的囊胚稱為孤雌囊胚,分離孤雌囊胚ICM建立胚胎干細(xì)胞系稱為孤雌胚胎干細(xì)胞(parthenogenetic embryonic stem cells, PESCs)系。孤雌胚胎干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞一樣具有分化潛能,而且哺乳動(dòng)物孤雌胚胎源于單配子,不能發(fā)育為個(gè)體,因此利用人孤雌胚胎干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)不僅為干細(xì)胞研究提供了嶄新的實(shí)驗(yàn)來源,還避免了諸多倫理問題。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigmented epithelium,RPE)細(xì)胞位于神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間,成為血視網(wǎng)膜屏障的外層,控制著視網(wǎng)膜下間隙的化學(xué)成分,通過提供營養(yǎng)和代謝廢物來滋養(yǎng)視網(wǎng)膜。RPE細(xì)胞的異常增殖、結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失,可導(dǎo)致許多視網(wǎng)膜疾病,近年文獻(xiàn)報(bào)道人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的RPE細(xì)胞作為細(xì)胞移植供體來源有眾多優(yōu)勢,其細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)和免疫組織學(xué)特征與ARPE-19即人RPE組織來源建立的細(xì)胞系相比更接近人RPE細(xì)胞,并且具備吞噬功能,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已顯示改善視功能的療效。 本實(shí)驗(yàn)中采用完全人來源培養(yǎng)體系建立的人孤雌胚胎干細(xì)胞系,初步探討了hPESCs穩(wěn)定傳代與鑒定,并經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)形成RPE細(xì)胞的相關(guān)內(nèi)容,分化形成的RPE細(xì)胞同卵子提供者具有相同的基因型,用于視網(wǎng)膜再生治療完全沒有排斥反應(yīng),同時(shí)也證實(shí)了人孤雌胚胎干細(xì)胞同正常受精來源的人胚胎干細(xì)胞系具有同樣的誘導(dǎo)分化潛能,為孤雌干細(xì)胞的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),也為今后的再生治療應(yīng)用于臨床提供細(xì)胞來源和理論基礎(chǔ)。 目的：解凍復(fù)蘇已建立的穩(wěn)定傳代的人孤雌胚胎干細(xì)胞系,誘導(dǎo)hPESCs向RPE細(xì)胞分化,純化后的色素細(xì)胞通過免疫組化分析,與人胎兒RPE細(xì)胞對比,證實(shí)復(fù)蘇后建立的hPESCs系同樣具有穩(wěn)定傳代及高效的誘導(dǎo)分化潛能。 對象和方法：利用天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心已成功建立的人孤雌胚胎干細(xì)胞系,解凍復(fù)蘇第16及第18代hPESC,應(yīng)用人包皮成纖維細(xì)胞作為飼養(yǎng)層,使用加入80%KnockOut DMEM、20%KnockOut血清替代物、2mML-谷氨酰胺、0.1mMβ巰基乙醇、8ng/mlbFGF等的hPESCs培養(yǎng)基,建立人孤雌胚胎干細(xì)胞系并穩(wěn)定傳代,并且對其特異性標(biāo)志物SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、 TRA-1-60、TRA-1-81、轉(zhuǎn)錄因子Oct-4,堿性磷酸酶,體內(nèi)或體外分化能力作全面的鑒定。最后,通過hPESCs擴(kuò)增、分化色素上皮細(xì)胞、豐富擴(kuò)增色素上皮細(xì)胞和向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化四步誘導(dǎo)其向RPE細(xì)胞分化,并對分化各階段細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色,了解誘導(dǎo)分化的效果。 結(jié)果：利用本實(shí)驗(yàn)室建立的人孤雌胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)方法和改良的同源性培養(yǎng)體系,復(fù)蘇后的人孤雌胚胎干細(xì)胞hPESCs-100616及hPESCs-100618體外長期擴(kuò)增均超過5代,經(jīng)鑒定分別保持人孤雌胚胎干細(xì)胞的特性,表現(xiàn)了良好的增殖與自我更新特性。向視網(wǎng)膜色素上皮分化過程中,在加入bFGF因子培養(yǎng)基中,3-4周hPESCs可形成色素細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)2-3周后可以形成多邊形的色素細(xì)胞簇,4-6周后棕黑色色素顆�？梢匝由斓郊�(xì)胞簇邊緣部。無bFGF因子誘導(dǎo)的自發(fā)分化培養(yǎng)亦可以獲得與之相類似的結(jié)果。該現(xiàn)象與人胎兒視網(wǎng)膜色素上皮色素沉積過程一致。上皮形態(tài)與色素表達(dá)均提示,該細(xì)胞為人孤雌胚胎干細(xì)胞來源的RPE細(xì)胞。 結(jié)論：已經(jīng)建立的人包皮成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層(human foreskin fibroblasts,HFF)與hPESCs培養(yǎng)體系完全適用于解凍復(fù)蘇后的hPESCs,可以維持hPESCs保持高度增殖及不發(fā)生自發(fā)分化的特性。利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)hPESCs向視網(wǎng)膜色素上皮分化的過程達(dá)到預(yù)期目的,證實(shí)了bFGF有對神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化的作用,未加細(xì)胞因子的自發(fā)分化組同樣有部分細(xì)胞分化為RPE細(xì)胞,但色素顆粒較前組少,分化效率較低。兩種分化方法均可達(dá)到預(yù)期目的,考慮經(jīng)濟(jì)、效率等綜合問題,究竟哪種方法更適合臨床應(yīng)用還需要繼續(xù)探索。實(shí)驗(yàn)最后獲得大量RPE細(xì)胞,為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞用于臨床研究提供了更新更安全的細(xì)胞來源和理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉毅;;胚胎干細(xì)胞在眼科的研究進(jìn)展[J];國際眼科雜志;2006年04期

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本文編號：2709317