【摘要】：麗沙病毒(Lyssavirus)感染動(dòng)物或人類引起狂犬病,狂犬病是一種動(dòng)物源性傳染病。麗沙病毒最初感染機(jī)體時(shí),不進(jìn)入血液循環(huán),也無臨床癥狀,當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀,如發(fā)熱、吞咽困難、唾液過多、恐水和麻痹時(shí),一般才被確診。但當(dāng)患者一旦發(fā)病,將無藥物或疫苗可用,致死率達(dá)100%。近年來,狂犬病死亡人數(shù)一直高居我國傳染病死亡人數(shù)前列,麗沙病毒給人民群眾生命健康及公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)重威脅。麗沙病毒是典型的囊膜病毒,表面G蛋白是參與病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的唯一因子,而與病毒G蛋白作用的宿主細(xì)胞膜表面受體目前尚不明確。此外,雖然已知麗沙病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是pH依賴的內(nèi)吞過程,但此類病毒仍與其他pH依賴的囊膜病毒不同(如甲型流感病毒、HCV、絲狀病毒等)。本課題組主要從事病毒進(jìn)入抑制劑的發(fā)現(xiàn)及機(jī)制研究,前期也已發(fā)現(xiàn)了一些絲狀病毒、冠狀病毒和沙粒病毒的進(jìn)入抑制劑,建立以麗沙病毒G蛋白包裹慢病毒核心的假病毒模型,將有助于研究這些抑制劑的作用機(jī)制。此外,由于麗沙病毒受體的復(fù)雜性和對(duì)氫離子濃度的敏感性均有自身的特點(diǎn),發(fā)現(xiàn)麗沙病毒進(jìn)入抑制劑,將有助于理解此家族病毒的進(jìn)入機(jī)制,并且對(duì)目前仍無藥可用的麗沙病毒藥物研發(fā)也有提示作用。基于上述目的,本論文針對(duì)最早確定的7種基因型麗沙病毒構(gòu)建了以G蛋白包裹慢病毒核心的假病毒。這7 種病毒分別為 Rabies lyssavirus(RABV)、Lagos bat lyssavirus(LBV)、Mokola lyssavirus(MOKV)、Duvenhage lyssavirus(DUVV)、European bat 1 lyssavirus(EBLV-1)、European bat 2 lyssavirus(EBLV-2)和 Australian bat lyssavirus(ABLV)。針對(duì)上述7種病毒,本論文首先構(gòu)建了病毒表面糖蛋白G的表達(dá)質(zhì)粒,考察G蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá),然后將G蛋白質(zhì)粒與敲除外殼基因并帶有熒光素酶報(bào)告基因的HIV-1核心質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞,兩種基因表達(dá)并包裝生成lyssavirus-G/HIV假病毒,隨后優(yōu)化了假病毒的包裝條件,最后考察了假病毒的感染性。結(jié)果顯示,所構(gòu)建的7種病毒(RABV、ABLV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、LBV和MOKV)的表面糖蛋白表達(dá)質(zhì)粒均可在293T細(xì)胞中有較高表達(dá),其中有6種病毒(DUVV、EBLV-1、EBLV-2、RABV、LBV 和 MOKV)的 G 蛋白能夠與HIV-1核心包裝成具有感染性的病毒。通過優(yōu)化去除G蛋白羧基端His標(biāo)簽后,RABV和MOKV假病毒感染能力提高100倍。隨后,本論文又通過優(yōu)化GP質(zhì)粒與HIV核心質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染總量及比例確定假病毒的包裝條件,結(jié)果顯示,6孔板最佳質(zhì)粒轉(zhuǎn)染總量為2 μg,假病毒最佳質(zhì)粒轉(zhuǎn)染比例分別為DUVV-G:HIV-luc =1:8;EBLV-1-G:HIV-luc =1:8;EBLV-2-G:HIV-luc =1:8;MOKV-G:HIV-luc =1:8;RABV-G:HIV-luc=1:4,LBV-G:HIV-luc=1:16。優(yōu)化后的假病毒(DUVV-G/HIV-luc、EBLV-1-G/HIV-luc、EBLV-2-G/HIV-luc、LBV-G/HIV-luc、MOKV-G/HIV-luc 和RABV-G/HIV-luc)感染293T細(xì)胞信號(hào)值均超過1×106RLUs,且感染的病毒量與熒光素酶相對(duì)活性呈相關(guān)性。最后,本論文檢測了麗沙病毒對(duì)不同種屬、不同組織來源細(xì)胞的感染性,結(jié)果顯示:人源細(xì)胞系中,A549(肺癌細(xì)胞系)、U87MG(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系)和293T(腎細(xì)胞系)對(duì)多數(shù)麗沙病毒易感,信號(hào)值均超過了 1×106RLUs,此結(jié)果與麗沙病毒的嗜神經(jīng)性和組織分布特性相符。倉鼠腎細(xì)胞系(BHK-21)也對(duì)大多數(shù)麗沙病毒易感,提示嚙齒動(dòng)物有作為麗沙病毒宿主的可能性。綜上所述,本論文應(yīng)用假病毒技術(shù)建立了 6種麗沙假病毒模型(DUVV-G/HIV-luc、EBLV-1-G/HIV-luc、EBLV-2-G/HIV-luc、LBV-G/HIV-luc、MOKV-G/HIV-luc和RABV-G/HIV-luc),并利用這6種麗沙假病毒對(duì)不同種屬、不同組織來源細(xì)胞的感染性進(jìn)行了初步研究。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373

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