【摘要】：麗沙病毒(Lyssavirus)感染動物或人類引起狂犬病,狂犬病是一種動物源性傳染病。麗沙病毒最初感染機體時,不進入血液循環(huán),也無臨床癥狀,當出現(xiàn)臨床癥狀,如發(fā)熱、吞咽困難、唾液過多、恐水和麻痹時,一般才被確診。但當患者一旦發(fā)病,將無藥物或疫苗可用,致死率達100%。近年來,狂犬病死亡人數(shù)一直高居我國傳染病死亡人數(shù)前列,麗沙病毒給人民群眾生命健康及公共衛(wèi)生帶來嚴重威脅。麗沙病毒是典型的囊膜病毒,表面G蛋白是參與病毒進入宿主細胞的唯一因子,而與病毒G蛋白作用的宿主細胞膜表面受體目前尚不明確。此外,雖然已知麗沙病毒進入宿主細胞是pH依賴的內(nèi)吞過程,但此類病毒仍與其他pH依賴的囊膜病毒不同(如甲型流感病毒、HCV、絲狀病毒等)。本課題組主要從事病毒進入抑制劑的發(fā)現(xiàn)及機制研究,前期也已發(fā)現(xiàn)了一些絲狀病毒、冠狀病毒和沙粒病毒的進入抑制劑,建立以麗沙病毒G蛋白包裹慢病毒核心的假病毒模型,將有助于研究這些抑制劑的作用機制。此外,由于麗沙病毒受體的復雜性和對氫離子濃度的敏感性均有自身的特點,發(fā)現(xiàn)麗沙病毒進入抑制劑,將有助于理解此家族病毒的進入機制,并且對目前仍無藥可用的麗沙病毒藥物研發(fā)也有提示作用。基于上述目的,本論文針對最早確定的7種基因型麗沙病毒構建了以G蛋白包裹慢病毒核心的假病毒。這7 種病毒分別為 Rabies lyssavirus(RABV)、Lagos bat lyssavirus(LBV)、Mokola lyssavirus(MOKV)、Duvenhage lyssavirus(DUVV)、European bat 1 lyssavirus(EBLV-1)、European bat 2 lyssavirus(EBLV-2)和 Australian bat lyssavirus(ABLV)。針對上述7種病毒,本論文首先構建了病毒表面糖蛋白G的表達質(zhì)粒,考察G蛋白在真核細胞中的表達,然后將G蛋白質(zhì)粒與敲除外殼基因并帶有熒光素酶報告基因的HIV-1核心質(zhì)粒共轉293T細胞,兩種基因表達并包裝生成lyssavirus-G/HIV假病毒,隨后優(yōu)化了假病毒的包裝條件,最后考察了假病毒的感染性。結果顯示,所構建的7種病毒(RABV、ABLV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、LBV和MOKV)的表面糖蛋白表達質(zhì)粒均可在293T細胞中有較高表達,其中有6種病毒(DUVV、EBLV-1、EBLV-2、RABV、LBV 和 MOKV)的 G 蛋白能夠與HIV-1核心包裝成具有感染性的病毒。通過優(yōu)化去除G蛋白羧基端His標簽后,RABV和MOKV假病毒感染能力提高100倍。隨后,本論文又通過優(yōu)化GP質(zhì)粒與HIV核心質(zhì)粒的轉染總量及比例確定假病毒的包裝條件,結果顯示,6孔板最佳質(zhì)粒轉染總量為2 μg,假病毒最佳質(zhì)粒轉染比例分別為DUVV-G:HIV-luc =1:8;EBLV-1-G:HIV-luc =1:8;EBLV-2-G:HIV-luc =1:8;MOKV-G:HIV-luc =1:8;RABV-G:HIV-luc=1:4,LBV-G:HIV-luc=1:16。優(yōu)化后的假病毒(DUVV-G/HIV-luc、EBLV-1-G/HIV-luc、EBLV-2-G/HIV-luc、LBV-G/HIV-luc、MOKV-G/HIV-luc 和RABV-G/HIV-luc)感染293T細胞信號值均超過1×106RLUs,且感染的病毒量與熒光素酶相對活性呈相關性。最后,本論文檢測了麗沙病毒對不同種屬、不同組織來源細胞的感染性,結果顯示:人源細胞系中,A549(肺癌細胞系)、U87MG(膠質(zhì)母細胞瘤細胞系)和293T(腎細胞系)對多數(shù)麗沙病毒易感,信號值均超過了 1×106RLUs,此結果與麗沙病毒的嗜神經(jīng)性和組織分布特性相符。倉鼠腎細胞系(BHK-21)也對大多數(shù)麗沙病毒易感,提示嚙齒動物有作為麗沙病毒宿主的可能性。綜上所述,本論文應用假病毒技術建立了 6種麗沙假病毒模型(DUVV-G/HIV-luc、EBLV-1-G/HIV-luc、EBLV-2-G/HIV-luc、LBV-G/HIV-luc、MOKV-G/HIV-luc和RABV-G/HIV-luc),并利用這6種麗沙假病毒對不同種屬、不同組織來源細胞的感染性進行了初步研究。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373

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本文編號：2706597