【摘要】：曾毅院士實驗室主要研究治療性艾滋病疫苗，前期提出的多載體HIV疫苗序貫和重復(fù)免疫的策略能在小鼠及恒河猴體內(nèi)誘導(dǎo)高水平、持久的HIV特異性免疫反應(yīng)。多載體疫苗中的DNA和rMVA疫苗目前正在HIV-1感染者中進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗，rAd5疫苗也已經(jīng)申報Ⅰ期臨床研究。本研究主要對上述三種載體為基礎(chǔ)的艾滋病疫苗聯(lián)合免疫的方案進(jìn)行深入探討，為申報三種疫苗聯(lián)合應(yīng)用的Ⅰ期臨床試驗提供依據(jù)。一方面對表達(dá)HIV基因的上述疫苗的免疫劑量、免疫間隔及免疫順序等進(jìn)行優(yōu)化；同時，從我國CRF01_AE亞型感染者中克隆env基因，構(gòu)建多載體疫苗，為與其他亞型疫苗聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)更廣譜的免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。另一方面構(gòu)建表達(dá)SIV gag及env基因的三種載體疫苗，采用上述優(yōu)化的免疫方案先在小鼠體內(nèi)進(jìn)行聯(lián)合免疫效果的觀察，為進(jìn)一步在感染SIV的恒河猴模型內(nèi)進(jìn)行疫苗治療效果的評價奠定基礎(chǔ)。 表達(dá)HIV-1基因的DNA、rMVA及rAd5疫苗單獨免疫后細(xì)胞免疫反應(yīng)高峰均出現(xiàn)在免疫后2w。DNA單獨免疫1次或2次以及三種不同劑量的rMVA疫苗單獨免疫產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)都較弱，各組間差別不顯著。三種不同劑量的rAd5疫苗單獨免疫均可產(chǎn)生較高水平特異性細(xì)胞免疫。因而rMVA疫苗和rAd5疫苗都選擇中劑量，DNA疫苗選擇免疫2次。兩種疫苗聯(lián)合應(yīng)用時，DNA與rAd5聯(lián)合免疫效果優(yōu)于DNA與rMVA聯(lián)合。DNA與rAd5疫苗免疫間隔4w誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)強于免疫間隔3w；DNA與rMVA疫苗免疫間隔4w與3w誘導(dǎo)的反應(yīng)水平無統(tǒng)計學(xué)差異。隨著時間推移，各組免疫反應(yīng)水平均有所下降。三種疫苗聯(lián)合應(yīng)用時采用DNA疫苗初免兩次、間隔2w，第二種疫苗rMVA或rAd5與DNA疫苗免疫間隔4w，第三種疫苗rAd5或rMVA采用6w及4w兩種不同間隔以進(jìn)一步優(yōu)化方案。結(jié)果第三種疫苗免疫后各組小鼠都能誘導(dǎo)強而且持久的Gag特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，在末次免疫后12w仍維持在比較高的水平。總結(jié)上述研究結(jié)果為了使疫苗能更持久誘導(dǎo)高水平免疫反應(yīng)，最佳的免疫方案為： DNA疫苗初免2次、間隔2w，再間隔4w rAd5疫苗加強免疫，間隔6wrMVA疫苗加強免疫。 上述DNA和rMVA疫苗表達(dá)B′/C重組型HIV-1基因，rAd5疫苗表達(dá)B′亞型HIV-1基因。近年來，CRF01_AE亞型也成為我國的主要流行亞型，設(shè)計針對該亞型的疫苗迫在眉睫。將表達(dá)多種不同亞型的疫苗聯(lián)合應(yīng)用可能誘導(dǎo)更廣譜的免疫反應(yīng)。因此本研究從A/E亞型感染者的血液標(biāo)本中克隆env基因，對其共享序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，成功構(gòu)建了DNA疫苗，能有效表達(dá)env基因。在小鼠體內(nèi)能誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫應(yīng)答。同時，也對克隆得到env序列的基因特性進(jìn)行了分析。V1、V2、V4和V5區(qū)在氨基酸長度的多態(tài)性上變化較大，而V3區(qū)相對較為保守。對Env氨基酸序列中N-糖基化位點的分析顯示V3，C3，C4及V5區(qū)糖基化位點的數(shù)目變化不大。gp41區(qū)的糖基化位點主要集中在跨膜區(qū)外側(cè)的胞外功能域。還進(jìn)一步構(gòu)建含有上述env序列的假病毒，共獲得8株滴度較高的假病毒，均為R5嗜性；檢測了假病毒對5種已知廣譜中和抗體和不同亞型HIV-1感染者血漿的中和敏感性。結(jié)果8株假病毒均對2G12中和抗體不敏感，對VRC_01、PG9，PG16及NIH45-46中和抗體比較敏感；對A/E及B/C亞型血漿抗體較為敏感，而對B′亞型血漿的中和敏感性較弱。該結(jié)果為研究CRF01_AE亞型疫苗的抗原特性及評價疫苗的免疫反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。 同時，為方便評價前述三載體疫苗聯(lián)合應(yīng)用的治療效果，本研究構(gòu)建了表達(dá)SIV gag/env優(yōu)化基因的DNA、rMVA及rAd5多載體疫苗。DNA水平和蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果證明，包含這兩種基因的三種載體疫苗可以有效表達(dá)相應(yīng)的目的基因；在小鼠體內(nèi)初步的免疫效果評價表明構(gòu)建的三種載體疫苗均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的Gag/Env特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。將進(jìn)一步在SIV感染的猴模型中進(jìn)行治療效果的評價，，為申報臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。
【圖文】：

第1章 緒論景陷病毒（HIV）概述病毒 1 型（human immunodeficiency virus type o合征（acquired immune deficiency syndrom, AIDS滋病規(guī)劃署 2013 年的報告估計[3]，2012 年世界，新發(fā)感染人數(shù)仍以每年超過 200 萬的數(shù)字居高者總數(shù)仍在持續(xù)增長，每年將近 160 萬的感染者鏈 RNA 病毒，隸屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬。成熟為二十面體對稱球形。電鏡下觀察可見致密的圓子和酶（如圖 1-1）。

避宿主的免疫控制。同時，由于 HIV 的膜蛋白 Env 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，免疫原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對 Env 抗原的廣譜中和抗體。由于 gp41 胞內(nèi)尾區(qū)的存 Env 蛋白的低表達(dá)也被認(rèn)為是 HIV/SIV 病毒免疫逃逸機制之一[15]，據(jù) HIV 病毒刺突的數(shù)目僅約為 7-16 個[16-18]。同時 Env 蛋白中表面蛋白 糖基化程度非常高，約占其分子量的 50%左右[19]，這些因素都減少了表位的暴露，使病毒得以逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[20]。缺乏有效的動物模型滋病疫苗研發(fā)的主要障礙之一。由于 HIV-1 無法感染猴，可以感染黑猩不致病[21, 22]，因此用其它類似的病毒感染相應(yīng)宿主并致病來模擬 HIV進(jìn)程是目前一個主要選擇。猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency ）是猴 AIDS 的致病因子，由于 SIV 和 HIV-1 有較高的同源性和相似的構(gòu)，且 SIV 感染恒河猴可引起與 HIV-1 感染人類類似的病理過程和免疫4]，盡管并不能完全以SIV感染猴模型來預(yù)測和評判HIV預(yù)防性疫苗的在評價治療性疫苗策略的有效性上還是具有一定的指導(dǎo)意義。4 艾滋病疫苗的主要免疫保護策略
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392

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本文編號：2705905