【摘要】：目的肺炎鏈球菌的磷壁酸（teichoic acids，TA）是主要毒力因子之一，對細菌在宿主體內(nèi)外生存具有重要意義。肺炎鏈球菌依賴磷壁酸維持菌體表面陽離子環(huán)境穩(wěn)定；同時，肺炎鏈球菌利用磷壁酸膽堿基團為膽堿結(jié)合蛋白提供錨定位點等。生物信息學分析提示肺炎鏈球菌磷壁酸生物合成是多蛋白參與的復雜代謝過程。磷壁酸共價連接至細胞壁是完整細菌細胞壁的關鍵環(huán)節(jié)，但其機制目前尚不清楚。本課題組前期研究顯示RafX（SPD_1672）可能與磷壁酸代謝相關，但rafX基因特點、rafX基因缺失對細菌表型的影響、RafX蛋白相關特征、RafX蛋白在磷壁酸代謝中的功能及其毒力機制仍有待深入研究。 方法利用生物信息學軟件或數(shù)據(jù)庫分析rafX基因在基因組中的位置及其相關功能，利用RT-PCR的方法了解rafX基因的轉(zhuǎn)錄特征。ΔrafX缺陷菌體外培養(yǎng)，，以了解rafX基因?qū)毦硇陀绊�；利用光學顯微鏡和透射電鏡觀察rafX基因缺陷株細菌形態(tài)學特征；通過構建RafX-GFP融合蛋白并利用激光共聚焦和Western blotting分析RafX蛋白的亞細胞定位。在第二部分實驗中，首先利用不同處理方法，包括2%膽堿洗脫、5%SDS處理、蛋白酶K水解、構建lgt缺陷菌、溶菌酶和變?nèi)芫厮狻⒚撗跄懰猁}水解研究磷壁酸分子特征。在獲得相關基礎信息后，利用Western blotting檢測rafX基因缺陷株磷壁酸的改變，利用FACS技術檢測細菌表面磷壁酸含量。運用生物信息學軟件分析RafX胞外活性環(huán)（EL4）的連接酶作用，利用丙氨酸定點突變技術研究EL4結(jié)構域及關鍵氨基酸以證實RafX蛋白的連接酶功能。利用PCR方法擴增20多種不同ST肺炎鏈球菌臨床菌株，并利用Westernblotting分析臨床菌株磷壁酸條帶分布和含量，以明確RafX蛋白介導的磷壁酸代謝保守性。最后，通過粘附實驗，腹腔和鼻腔攻毒實驗研究磷壁酸在粘附和毒力中的作用。 結(jié)果生物信息學分析提示RafX蛋白具有O-抗原連接酶功能。rafX基因與其上游基因gtfA共轉(zhuǎn)錄。相比野生D39菌株，D39ΔrafX缺陷株血平板生長后菌落較��；D39ΔrafX缺陷體外培養(yǎng)表現(xiàn)為生長遲緩、自溶提前、平臺期縮短等現(xiàn)象；光學顯微鏡和電鏡下可見D39ΔrafX缺陷菌鏈變短；另外，電鏡下可見D39ΔrafX缺陷菌分裂和形態(tài)異常。盡管如此，細菌對DOC的敏感性相同，與自溶相關的自溶酶A（lytA）總量和表面含量相同。利用GFP標簽蛋白對RafX蛋白進行亞細胞定位分析得到，RafX蛋白位于細胞膜上，蛋白N端和C端均位于胞內(nèi)。 本研究發(fā)現(xiàn)利用不同的分析方法包括2%膽堿洗脫、SDS處理、溶菌酶和變?nèi)芫厮狻⒚撗跄懰猁}水解所分析的成分為壁磷壁酸（WTA）與肽聚糖（PG）復合物（WTA-PG），而非文獻報道的脂磷壁酸（LTA）。蛋白酶K水解、構建lgt缺陷菌并不改變磷壁酸條帶，溶菌酶過度水解條帶分子量變小進一步證實所分析的磷壁酸成分為WTA-PG復合物。Western blotting分析發(fā)現(xiàn)RafX缺陷細菌WTA-PG條帶異常，含量降低。FACS和ELISA方法證實RafX缺陷菌表面磷壁酸含量降低，這些結(jié)果提示RafX與細菌表面磷壁酸含量有關。PCR結(jié)果顯示，所有20多種ST型細菌臨床菌株均表達rafX基因，同時測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)rafX基因DNA序列保守性超過99.9%。另外，所有臨床菌株均有磷壁酸特征條帶，無條帶后移現(xiàn)象。Molegro Virtual Docker軟件對EL4環(huán)和截斷的磷壁酸前體分子（C14H26O7P2）進行分子對接模擬提示，磷壁酸前體分子能以配體的形式與EL4環(huán)的Arg260與His304、His306形成氫鍵，能被RafX EL4結(jié)構域結(jié)合，提示RafX可能具有磷壁酸連接酶功能。丙氨酸惰性替代研究證實RafX蛋白的連接酶功能，研究發(fā)現(xiàn)H151、R154、R266、W270、G284、P287、H304A和H306是RafX蛋白酶活性的關鍵氨基酸。 體外粘附實驗顯示，Anti-CWPS抗血清能夠顯著抑制野生R6對MLE12和HUVEC細胞的粘附，提示磷壁酸分子本身與細菌粘附密切相關。而缺陷rafX后，R6的粘附能力僅為野生菌株的10-15%，這與rafX影響磷壁酸的連接結(jié)果相吻合。RafXΔEL4、H306A突變體回復的R6ΔrafX菌株其粘附能力仍與R6ΔrafX菌株相同，而RafX H106A突變體回復的R6ΔrafX菌株其粘附能力與野生R6相同，說明細菌粘附能力的變化與RafX蛋白本身無關。流式細胞術分析顯示，R6和TIGR4ΔrafX細菌表面的CbpA顯著下降，提示CbpA的表達下調(diào)與rafX缺陷菌粘附能力的下降有一定關系，這也與rafX缺陷菌磷壁酸減少導致細菌表面膽堿減少的結(jié)果相吻合。 小鼠感染野生RafX、RafX H106A和RafX WL回補菌后全部死亡，而感染ΔrafX和RafX H306A回補菌的小鼠存活率顯著延長，感染D39的小鼠肺組織出現(xiàn)了典型的出血、壞死，大量炎性細胞浸潤等改變，而感染D39ΔrafX的缺陷菌，小鼠肺部炎癥反應較輕，未見明顯的出血壞死等病灶，提示磷壁酸在細菌毒力中的重要作用。此外，感染缺陷菌小鼠的鼻咽部、肺、腦和血液中的細菌載量顯著低于野生細菌，進一步說明磷壁酸與細菌的粘附和侵襲性疾病的發(fā)生有關。為了明確細菌毒力變化是由其生長缺陷還是對天然免疫細胞抵抗減弱所致，我們將D39和D39ΔrafX培養(yǎng)至兔血清、兔抗凝全血或分別與中性粒細胞和巨噬細胞共同孵育，結(jié)果顯示，ΔrafX缺陷菌在兔血清中的生長顯著減緩；然而，相比野生D39，ΔrafX缺陷菌抵抗天然免疫細胞殺傷能力并無顯著差異，提示D39ΔrafX生長缺陷是導致細菌毒力變化主要原因。 結(jié)論rafX基因缺陷影響細菌生長、自溶、細菌形態(tài)和分裂。RafX可能是一種連接酶參與肺炎鏈球菌磷壁酸胞外連接。RafX介導的磷壁酸代謝在親緣性高的鏈球菌屬細菌中有一定保守性。磷壁酸本身是一種重要的非蛋白粘附素，同時也能影響粘附相關蛋白如CbpA蛋白表面的分布，協(xié)同影響細菌粘附。RafX缺陷菌其毒力下降主要與其生長缺陷和表面毒力因子表達下調(diào)有關。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.1;R3416

【共引文獻】

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本文編號：2704626