【摘要】：目的肺炎鏈球菌的磷壁酸（teichoic acids，TA）是主要毒力因子之一，對細(xì)菌在宿主體內(nèi)外生存具有重要意義。肺炎鏈球菌依賴磷壁酸維持菌體表面陽離子環(huán)境穩(wěn)定；同時(shí)，肺炎鏈球菌利用磷壁酸膽堿基團(tuán)為膽堿結(jié)合蛋白提供錨定位點(diǎn)等。生物信息學(xué)分析提示肺炎鏈球菌磷壁酸生物合成是多蛋白參與的復(fù)雜代謝過程。磷壁酸共價(jià)連接至細(xì)胞壁是完整細(xì)菌細(xì)胞壁的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但其機(jī)制目前尚不清楚。本課題組前期研究顯示RafX（SPD_1672）可能與磷壁酸代謝相關(guān)，但rafX基因特點(diǎn)、rafX基因缺失對細(xì)菌表型的影響、RafX蛋白相關(guān)特征、RafX蛋白在磷壁酸代謝中的功能及其毒力機(jī)制仍有待深入研究。 方法利用生物信息學(xué)軟件或數(shù)據(jù)庫分析rafX基因在基因組中的位置及其相關(guān)功能，利用RT-PCR的方法了解rafX基因的轉(zhuǎn)錄特征。ΔrafX缺陷菌體外培養(yǎng)，，以了解rafX基因?qū)?xì)菌表型影響；利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察rafX基因缺陷株細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征；通過構(gòu)建RafX-GFP融合蛋白并利用激光共聚焦和Western blotting分析RafX蛋白的亞細(xì)胞定位。在第二部分實(shí)驗(yàn)中，首先利用不同處理方法，包括2%膽堿洗脫、5%SDS處理、蛋白酶K水解、構(gòu)建lgt缺陷菌、溶菌酶和變?nèi)芫厮狻⒚撗跄懰猁}水解研究磷壁酸分子特征。在獲得相關(guān)基礎(chǔ)信息后，利用Western blotting檢測rafX基因缺陷株磷壁酸的改變，利用FACS技術(shù)檢測細(xì)菌表面磷壁酸含量。運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析RafX胞外活性環(huán)（EL4）的連接酶作用，利用丙氨酸定點(diǎn)突變技術(shù)研究EL4結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸以證實(shí)RafX蛋白的連接酶功能。利用PCR方法擴(kuò)增20多種不同ST肺炎鏈球菌臨床菌株，并利用Westernblotting分析臨床菌株磷壁酸條帶分布和含量，以明確RafX蛋白介導(dǎo)的磷壁酸代謝保守性。最后，通過粘附實(shí)驗(yàn)，腹腔和鼻腔攻毒實(shí)驗(yàn)研究磷壁酸在粘附和毒力中的作用。 結(jié)果生物信息學(xué)分析提示RafX蛋白具有O-抗原連接酶功能。rafX基因與其上游基因gtfA共轉(zhuǎn)錄。相比野生D39菌株，D39ΔrafX缺陷株血平板生長后菌落較小；D39ΔrafX缺陷體外培養(yǎng)表現(xiàn)為生長遲緩、自溶提前、平臺(tái)期縮短等現(xiàn)象；光學(xué)顯微鏡和電鏡下可見D39ΔrafX缺陷菌鏈變短；另外，電鏡下可見D39ΔrafX缺陷菌分裂和形態(tài)異常。盡管如此，細(xì)菌對DOC的敏感性相同，與自溶相關(guān)的自溶酶A（lytA）總量和表面含量相同。利用GFP標(biāo)簽蛋白對RafX蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析得到，RafX蛋白位于細(xì)胞膜上，蛋白N端和C端均位于胞內(nèi)。 本研究發(fā)現(xiàn)利用不同的分析方法包括2%膽堿洗脫、SDS處理、溶菌酶和變?nèi)芫厮�、脫氧膽酸鹽水解所分析的成分為壁磷壁酸（WTA）與肽聚糖（PG）復(fù)合物（WTA-PG），而非文獻(xiàn)報(bào)道的脂磷壁酸（LTA）。蛋白酶K水解、構(gòu)建lgt缺陷菌并不改變磷壁酸條帶，溶菌酶過度水解條帶分子量變小進(jìn)一步證實(shí)所分析的磷壁酸成分為WTA-PG復(fù)合物。Western blotting分析發(fā)現(xiàn)RafX缺陷細(xì)菌WTA-PG條帶異常，含量降低。FACS和ELISA方法證實(shí)RafX缺陷菌表面磷壁酸含量降低，這些結(jié)果提示RafX與細(xì)菌表面磷壁酸含量有關(guān)。PCR結(jié)果顯示，所有20多種ST型細(xì)菌臨床菌株均表達(dá)rafX基因，同時(shí)測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)rafX基因DNA序列保守性超過99.9%。另外，所有臨床菌株均有磷壁酸特征條帶，無條帶后移現(xiàn)象。Molegro Virtual Docker軟件對EL4環(huán)和截?cái)嗟牧妆谒崆绑w分子（C14H26O7P2）進(jìn)行分子對接模擬提示，磷壁酸前體分子能以配體的形式與EL4環(huán)的Arg260與His304、His306形成氫鍵，能被RafX EL4結(jié)構(gòu)域結(jié)合，提示RafX可能具有磷壁酸連接酶功能。丙氨酸惰性替代研究證實(shí)RafX蛋白的連接酶功能，研究發(fā)現(xiàn)H151、R154、R266、W270、G284、P287、H304A和H306是RafX蛋白酶活性的關(guān)鍵氨基酸。 體外粘附實(shí)驗(yàn)顯示，Anti-CWPS抗血清能夠顯著抑制野生R6對MLE12和HUVEC細(xì)胞的粘附，提示磷壁酸分子本身與細(xì)菌粘附密切相關(guān)。而缺陷rafX后，R6的粘附能力僅為野生菌株的10-15%，這與rafX影響磷壁酸的連接結(jié)果相吻合。RafXΔEL4、H306A突變體回復(fù)的R6ΔrafX菌株其粘附能力仍與R6ΔrafX菌株相同，而RafX H106A突變體回復(fù)的R6ΔrafX菌株其粘附能力與野生R6相同，說明細(xì)菌粘附能力的變化與RafX蛋白本身無關(guān)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，R6和TIGR4ΔrafX細(xì)菌表面的CbpA顯著下降，提示CbpA的表達(dá)下調(diào)與rafX缺陷菌粘附能力的下降有一定關(guān)系，這也與rafX缺陷菌磷壁酸減少導(dǎo)致細(xì)菌表面膽堿減少的結(jié)果相吻合。 小鼠感染野生RafX、RafX H106A和RafX WL回補(bǔ)菌后全部死亡，而感染ΔrafX和RafX H306A回補(bǔ)菌的小鼠存活率顯著延長，感染D39的小鼠肺組織出現(xiàn)了典型的出血、壞死，大量炎性細(xì)胞浸潤等改變，而感染D39ΔrafX的缺陷菌，小鼠肺部炎癥反應(yīng)較輕，未見明顯的出血壞死等病灶，提示磷壁酸在細(xì)菌毒力中的重要作用。此外，感染缺陷菌小鼠的鼻咽部、肺、腦和血液中的細(xì)菌載量顯著低于野生細(xì)菌，進(jìn)一步說明磷壁酸與細(xì)菌的粘附和侵襲性疾病的發(fā)生有關(guān)。為了明確細(xì)菌毒力變化是由其生長缺陷還是對天然免疫細(xì)胞抵抗減弱所致，我們將D39和D39ΔrafX培養(yǎng)至兔血清、兔抗凝全血或分別與中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同孵育，結(jié)果顯示，ΔrafX缺陷菌在兔血清中的生長顯著減緩；然而，相比野生D39，ΔrafX缺陷菌抵抗天然免疫細(xì)胞殺傷能力并無顯著差異，提示D39ΔrafX生長缺陷是導(dǎo)致細(xì)菌毒力變化主要原因。 結(jié)論rafX基因缺陷影響細(xì)菌生長、自溶、細(xì)菌形態(tài)和分裂。RafX可能是一種連接酶參與肺炎鏈球菌磷壁酸胞外連接。RafX介導(dǎo)的磷壁酸代謝在親緣性高的鏈球菌屬細(xì)菌中有一定保守性。磷壁酸本身是一種重要的非蛋白粘附素，同時(shí)也能影響粘附相關(guān)蛋白如CbpA蛋白表面的分布，協(xié)同影響細(xì)菌粘附。RafX缺陷菌其毒力下降主要與其生長缺陷和表面毒力因子表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.1;R3416

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2704626