發(fā)布時(shí)間：2020-06-09 01:41

【摘要】：單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)簡(jiǎn)稱單增李斯特菌,是一種自然界普遍存在的人畜共患病病原菌,也是一種食源性病原菌,它能引起人、畜的李斯特菌病。食品中存在的單增李斯特菌威脅著人類的安全,該菌在溫度較低的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖,是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一。Lm-p60蛋白為單核細(xì)胞增生李斯特菌產(chǎn)生的一種胞外蛋白,由iap基因編碼,與李斯特菌的致病性密切相關(guān)。Lm-p60蛋白具有酰胺水解酶的活性,能夠水解細(xì)菌細(xì)胞壁,具有很高的研究?jī)r(jià)值。Lm-p60蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及結(jié)構(gòu)域功能的研究結(jié)果顯示:Lm-p60蛋白存在著N端和C端兩個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域,其中N端結(jié)構(gòu)域存在兩個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域和一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域,而C端只含有一個(gè)NlpC/P60家族結(jié)構(gòu)域。Lm-p60蛋白在裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的過程中,只有N端結(jié)構(gòu)域中的LysM和SH3具有結(jié)合底物功能,從而確定了 N端結(jié)構(gòu)域行使識(shí)別并結(jié)合底物的功能,而C端結(jié)構(gòu)域行使裂解底物功能。目前,Lm-P60蛋白是否具有抗菌性及抗菌效果如何還不是很清楚,而且Lm-p60蛋白在異源表達(dá)過程中還存在表達(dá)量不足和活性較低的問題。為了獲得大量高活性Lm-p60蛋白,本研究通過SDS-PAGE分析比較不同載體構(gòu)建的重組蛋白的表達(dá)量來確定最適表達(dá)載體,結(jié)果表明最適表達(dá)載體為pET30a。隨后,本研究以SDS-PAGE分析和比濁法測(cè)重組蛋白裂解細(xì)菌細(xì)胞壁活性確定了以pET30a載體構(gòu)建的重組蛋白最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件是:在細(xì)菌培養(yǎng)至OD600值為0.553時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,在搖床溫度為30 ℃,轉(zhuǎn)速為160 rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。然后通過SDS-PAGE分析和比濁法測(cè)裂解活性確定了最佳超聲波破碎時(shí)間為20 min。在最佳條件下誘導(dǎo)表達(dá)并用鎳柱親和層析純化Lm-p60蛋白,通過計(jì)算后Lm-p60蛋白的純化倍數(shù)為1.2,回收率達(dá)95%。細(xì)菌抗藥性及耐藥性問題日益突出,開發(fā)新的抗菌劑十分迫切。Lm-p60蛋白具有裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的活性,研究Lm-p60蛋白是否具有抗菌作用及抗菌效果如何成為一項(xiàng)重要的工作。本研究以溶壁微球菌為指示菌,瓊脂打孔法確定了 Lm-p60蛋白具有抑菌活性,其抑菌效果比溶菌酶要弱。溶菌酶作為研究較為透徹的抗菌酶,其裂解細(xì)胞壁原理與Lm-p60蛋白有所不同,本研究發(fā)現(xiàn),在溶菌酶中混合有Lm-p60蛋白后具有增強(qiáng)抑菌效果的重要結(jié)論。為溶菌酶的改造提供很好的材料。本研究還以pET30a載體構(gòu)建Lm-p60蛋白的N端結(jié)構(gòu)域與LysM2-C端重組蛋白。并通過比濁法測(cè)定發(fā)現(xiàn)N端結(jié)構(gòu)域也具有裂解活性,但抑菌效果不明顯,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)只含有一個(gè)LysM結(jié)構(gòu)域的C端重組蛋白裂解活性較弱。
【圖文】：

４邐揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文邐逡逑其由Ｐ－１，４－糖苷鍵將交替排列的Ｎ－乙酰葡萄糖胺（ＧｌｃＮＡｃ）和Ｎ－乙酰胞壁酸（ＭｕｒＮＡｃ）逡逑構(gòu)成（Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒ邋ａｎｄ邋Ｋａｎｄｌｅｒ，邋１９７２；邋Ｇｌａｕｎｅｒｅｔ邋ａｌ．，，邋１９８８）。這些雜多糖聚合物的糖鏈?zhǔn)峭ㄟ^寡肽逡逑橋連接，從而為細(xì)菌包膜提供剛性的晶格結(jié)構(gòu)（Ｒｏｌａｎｄｅｔａｌ．，２０１１）。革蘭氏陽(yáng)性菌與革蘭氏逡逑陰性菌肽聚糖的主要不同在其肽橋上，革蘭氏陽(yáng)性菌其肽橋的氨基酸組成一般為Ｌ－逡逑Ａｌａ＋Ｄ－Ｇｌｕ＋Ｌ－Ｌｙｓ＋Ｄ－Ａｌａ，革蘭氏陰性菌其肽橋的氨基酸組成為［－八＾＋０說１１＋１１１－０？１１１＋０－逡逑Ａｌａ邋（Ｖｏｌｌｍｅｒ邋ｅ？邋ａ／．，２００８；邋Ｖｏｌｌｍｅｒ邋ａｎｄ邋Ｓｅｌｉｇｍａｎ，邋２０１０）。Ｌｍ邋屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，但邋Ｌｍ邋細(xì)逡逑胞壁中的肽聚糖結(jié)構(gòu)與革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖結(jié)構(gòu)相似（Ｂｉｅｍｅ邋ａｎｄ邋Ｃｏｓｓａｒｔ，邋２００７）。逡逑Ｌｍ細(xì)胞壁中肽聚糖的結(jié)構(gòu)如圖１－２所示。逡逑

邐５逡逑酶與Ｌｍ－ｐ６０蛋白水解細(xì)胞壁位點(diǎn)不同（洛菌酶水解位點(diǎn)如圖１－２紅色箭頭所示），也為溶逡逑菌酶基因工程改造提供良好的材料。逡逑１．５Ｌｍ－ｐ６０蛋白的結(jié)構(gòu)域逡逑如圖１－３所示，Ｌｍ－ｐ６０蛋白氨基酸序列分析預(yù)測(cè)顯示：Ｌｍ－ｐ６０蛋白含有兩個(gè)ＬｙｓＭ和逡逑一個(gè)８１１３結(jié)構(gòu)域氨基酸基序，位于１＾末端；一個(gè)抑０（：／？６0家族結(jié)構(gòu)域的氨基酸基序（１１１0證），逡逑位于Ｃ末端。逡逑Ａ邋１邐２６邐６９邋８６邐１３９邐１９９邐２４３邐３７９邐４８２逡逑邐Ｌ邐ｊ—１邐Ｕ—ｊ邐１，邐，邋■、…逡逑ＳＰ邋ＬｙｓＭｌ邐ＳＨ３邐ＬｙｓＭ２邐ＮｌｐＣ／Ｐ６０邋ｆａｍｉｌｙ逡逑栜４邋，邋S緬義希洛義希玻峰危玻叮瑰危玻罰板危咤危危咤危矗福插義希擔(dān)蓿擔(dān)場(chǎng)齲齲儒危停停取五�！邋邋艺d邋尾峰義賢跡保吃げ獾牡ズ訟赴鏨釧固鼐穡叮暗鞍椎慕峁褂蠔腿督峁梗ǎ伲蹂澹澹簦幔歟�，邋２０１６）辶x希疲椋紓澹保沖澹裕瑁邋澹洌錚恚幔椋鑠澹錚潁紓幔睿椋幔簦椋錚鑠澹錚駑澹蹋恚穡叮板澹幔睿溴澹簦瑁邋澹穡潁澹洌椋悖簦澹溴澹螅簦潁酰悖簦酰潁澹簀澹錚駑澹蹋恚穡叮啊簀澹洌錚恚幔椋睿簀澹ǎ伲蹂澹澹翦澹幔歟義希玻埃保叮╁義希ǎ粒╁澹蹋恚穡叮敖峁褂蜃槌珊拖嚶峁褂蛉督峁乖げ饌

本文編號(hào)：2703981