【摘要】：鮑曼不動(dòng)桿菌是革蘭氏菌分類中的陰性桿菌,是一種條件致病菌。它不僅僅存在于醫(yī)院環(huán)境內(nèi),而且分布在自然生態(tài)環(huán)境中,常引起重要的感染性疾病,例如呼吸道感染、菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎以及手術(shù)部位感染等。近現(xiàn)代以來(lái),由于人們未能按照規(guī)范使用抗生素,從而導(dǎo)致了鮑曼不動(dòng)桿菌出現(xiàn)耐藥的情況,使得鮑曼不動(dòng)桿菌引發(fā)的感染性疾病出現(xiàn)難以醫(yī)治或無(wú)藥可醫(yī)的情況。近幾年,人們發(fā)現(xiàn)耐喹諾酮類抗生素的鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥菌株尤為突出。為此,我們針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌建立了一套可快速診斷菌種及其喹諾酮類耐藥基因的體系,該體系為院內(nèi)的臨床診斷及治療提供方法,以達(dá)到準(zhǔn)確用藥,及時(shí)治療的目的。目前針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的檢測(cè)方法主要有手工培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)、自動(dòng)培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)和質(zhì)譜分析等方法,前兩種方法存在耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度不高等弊端。質(zhì)譜分析的方法雖然快速且靈敏度高,但是該方法所用到的儀器昂貴而且需要細(xì)菌的前培養(yǎng),耗時(shí)長(zhǎng),較為繁瑣。所以本研究建立了基于PCR和LAMP法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的方法體系,且使用了PCR和多重PCR的方法對(duì)該菌中的喹諾酮類抗生素耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。首先,按照“種內(nèi)共有,種間特異”的原則,使用本地Blast及在線Blast的方法對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌全基因組進(jìn)行篩選,得到該菌的特異基因:CP018677.1(2912288..2912548)。針對(duì)該特異基因分別建立了PCR和LAMP檢測(cè)鑒定體系。使用162株鮑曼不動(dòng)桿菌及4株非鮑曼不動(dòng)桿菌(銅綠假單胞菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、志賀氏菌)樣本進(jìn)行特異性評(píng)估,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難看出,兩種方法均可用于鮑曼不動(dòng)桿菌的鑒定,特異性好。其次,分別使用梯度稀釋后的特異基因陽(yáng)性克隆和鮑曼不動(dòng)桿菌菌液分別作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增,對(duì)鑒定體系進(jìn)行靈敏度的評(píng)估,結(jié)果顯示:當(dāng)以陽(yáng)性克隆作為PCR模板時(shí),靈敏度可達(dá)到10~0個(gè)拷貝/反應(yīng);當(dāng)以菌液作為PCR反應(yīng)模板,靈敏度可達(dá)到10~1個(gè)拷貝/反應(yīng),鑒定體系靈敏度高。再其次,在耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)(ARDB)內(nèi)查找出喹諾酮類耐藥基因(qnr A、qnr B、qnr S)共3種,并下載所有種類的耐藥基因及其亞型,使用AlignX多序列比對(duì)軟件對(duì)所下載的耐藥基因序列進(jìn)行多序列比對(duì),并且針對(duì)比對(duì)的結(jié)果設(shè)計(jì)耐藥基因的引物。PCR法的檢測(cè)結(jié)果顯示,在162株鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株中,含有qnr A耐藥基因的菌株有67株,檢出率為41.36%;含有qnr B耐藥基因的菌株有38株,檢出率為23.46%;含有qnr S耐藥基因的菌株有145株,檢出率為89.51%。這與醫(yī)院所給出的菌株表現(xiàn)型基本一致,結(jié)果準(zhǔn)確。分別克隆出3種耐藥基因的陽(yáng)性質(zhì)粒,10倍梯度稀釋陽(yáng)性質(zhì)粒,并作為PCR模板,檢驗(yàn)體系的靈敏度。結(jié)果顯示qnr A、qnrS耐藥基因的靈敏度均可達(dá)到10~0個(gè)拷貝/反應(yīng),qnr B耐藥基因的靈敏度仍可達(dá)到10個(gè)拷貝/反應(yīng)。結(jié)果說(shuō)明,該鑒定體系靈敏度高。最后,將特異基因CP018677.1(2912288..2912548)和三種喹諾酮類耐藥基因qnr A、qnr B、qnrS的檢測(cè)組合在同一個(gè)多重PCR反應(yīng)體系中。通過(guò)該多重PCR結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)該多重PCR體系可同時(shí)檢測(cè)出特異基因及其所包含的喹諾酮類耐藥基因,且多重PCR結(jié)果與普通PCR檢測(cè)結(jié)果一致。由此可見(jiàn),本次實(shí)驗(yàn)成功的建立了基于PCR和LAMP法鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌及其所含喹諾酮類耐藥基因的方法體系,用于鑒定特異基因和喹諾酮類耐藥基因的引物均為首次使用。本研究成功的建立了多重PCR體系,該體系可快速高效的檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌及其喹諾酮類耐藥基因。
【圖文】：

圖 2.1 PCR 法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌特異性Fig 2.1 Specificity of the PCR assay to identify Acinetobactor baumannii1 泳道為 DL DNA2000 marker；2-9 泳道為鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株；10 泳道為銅綠假單胞菌；11 泳道為肺炎克雷伯菌；12 泳道為大腸桿菌；13 泳道為志賀氏菌；14 泳道為陰性對(duì)照Lane 1 was DL2000 DNAmarker, the template of lane 2 to 9 were clinical isolates ofAcinetobacter Baumanii. From Lane 10 to 14 were Pseudomonas aeruginosa, Klebsiellapneumoniae, Escherichia coli, Shiga bacillus and negative control.LAMP 法鑒定體系的特異性評(píng)估在該法鑒定特異基因的實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用到的試驗(yàn)菌株與上述 PCR 法一樣，包括：162 株鮑曼不動(dòng)桿菌菌株作為實(shí)驗(yàn)組，，肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌及志賀氏菌各一株作為對(duì)照組。由下圖可見(jiàn)，2-9 泳道均為鮑曼不動(dòng)桿2.3.2

圖 2.2 LAMP 法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌特異性Fig2.2 Specificity of the LAMPassay to identify Acinetobactor baumannii1 泳道為 DL2000 marker；2-9 泳道為鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株；10 泳道為銅綠假單胞菌；11 泳道為肺炎克雷伯氏菌；12 泳道為大腸桿菌；13 泳道為志賀氏菌；14 泳道為陰性對(duì)照Lane 1 was DL2000 marker, the template of lane 2 to 9 were clinical isolates ofAcinetobacterBaumanii. From Lane 10 to 14 were Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,Escherichia coli, Shiga bacillus and negative control.PCR 法鑒定體系的靈敏度評(píng)估（1）以梯度稀釋后的陽(yáng)性質(zhì)粒作為反應(yīng)的模板：經(jīng)由紫外分光光度計(jì)測(cè)出陽(yáng)性質(zhì)粒的初始濃度為 175 ng/μL，根據(jù)上述質(zhì)粒個(gè)數(shù)計(jì)算公式計(jì)算出所提取的陽(yáng)性質(zhì)粒的個(gè)數(shù)為 5.4×1010個(gè)/μL 。首先，取 102.3.3
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2703266