【摘要】：鮑曼不動桿菌是革蘭氏菌分類中的陰性桿菌,是一種條件致病菌。它不僅僅存在于醫(yī)院環(huán)境內(nèi),而且分布在自然生態(tài)環(huán)境中,常引起重要的感染性疾病,例如呼吸道感染、菌血癥、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎以及手術(shù)部位感染等。近現(xiàn)代以來,由于人們未能按照規(guī)范使用抗生素,從而導(dǎo)致了鮑曼不動桿菌出現(xiàn)耐藥的情況,使得鮑曼不動桿菌引發(fā)的感染性疾病出現(xiàn)難以醫(yī)治或無藥可醫(yī)的情況。近幾年,人們發(fā)現(xiàn)耐喹諾酮類抗生素的鮑曼不動桿菌耐藥菌株尤為突出。為此,我們針對鮑曼不動桿菌建立了一套可快速診斷菌種及其喹諾酮類耐藥基因的體系,該體系為院內(nèi)的臨床診斷及治療提供方法,以達(dá)到準(zhǔn)確用藥,及時治療的目的。目前針對鮑曼不動桿菌的檢測方法主要有手工培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)、自動培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)和質(zhì)譜分析等方法,前兩種方法存在耗費(fèi)時間長、靈敏度不高等弊端。質(zhì)譜分析的方法雖然快速且靈敏度高,但是該方法所用到的儀器昂貴而且需要細(xì)菌的前培養(yǎng),耗時長,較為繁瑣。所以本研究建立了基于PCR和LAMP法檢測鮑曼不動桿菌的方法體系,且使用了PCR和多重PCR的方法對該菌中的喹諾酮類抗生素耐藥基因進(jìn)行檢測。首先,按照“種內(nèi)共有,種間特異”的原則,使用本地Blast及在線Blast的方法對鮑曼不動桿菌全基因組進(jìn)行篩選,得到該菌的特異基因:CP018677.1(2912288..2912548)。針對該特異基因分別建立了PCR和LAMP檢測鑒定體系。使用162株鮑曼不動桿菌及4株非鮑曼不動桿菌(銅綠假單胞菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、志賀氏菌)樣本進(jìn)行特異性評估,從實(shí)驗(yàn)結(jié)果不難看出,兩種方法均可用于鮑曼不動桿菌的鑒定,特異性好。其次,分別使用梯度稀釋后的特異基因陽性克隆和鮑曼不動桿菌菌液分別作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增,對鑒定體系進(jìn)行靈敏度的評估,結(jié)果顯示:當(dāng)以陽性克隆作為PCR模板時,靈敏度可達(dá)到10~0個拷貝/反應(yīng);當(dāng)以菌液作為PCR反應(yīng)模板,靈敏度可達(dá)到10~1個拷貝/反應(yīng),鑒定體系靈敏度高。再其次,在耐藥基因數(shù)據(jù)庫(ARDB)內(nèi)查找出喹諾酮類耐藥基因(qnr A、qnr B、qnr S)共3種,并下載所有種類的耐藥基因及其亞型,使用AlignX多序列比對軟件對所下載的耐藥基因序列進(jìn)行多序列比對,并且針對比對的結(jié)果設(shè)計耐藥基因的引物。PCR法的檢測結(jié)果顯示,在162株鮑曼不動桿菌臨床分離株中,含有qnr A耐藥基因的菌株有67株,檢出率為41.36%;含有qnr B耐藥基因的菌株有38株,檢出率為23.46%;含有qnr S耐藥基因的菌株有145株,檢出率為89.51%。這與醫(yī)院所給出的菌株表現(xiàn)型基本一致,結(jié)果準(zhǔn)確。分別克隆出3種耐藥基因的陽性質(zhì)粒,10倍梯度稀釋陽性質(zhì)粒,并作為PCR模板,檢驗(yàn)體系的靈敏度。結(jié)果顯示qnr A、qnrS耐藥基因的靈敏度均可達(dá)到10~0個拷貝/反應(yīng),qnr B耐藥基因的靈敏度仍可達(dá)到10個拷貝/反應(yīng)。結(jié)果說明,該鑒定體系靈敏度高。最后,將特異基因CP018677.1(2912288..2912548)和三種喹諾酮類耐藥基因qnr A、qnr B、qnrS的檢測組合在同一個多重PCR反應(yīng)體系中。通過該多重PCR結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)該多重PCR體系可同時檢測出特異基因及其所包含的喹諾酮類耐藥基因,且多重PCR結(jié)果與普通PCR檢測結(jié)果一致。由此可見,本次實(shí)驗(yàn)成功的建立了基于PCR和LAMP法鑒定鮑曼不動桿菌及其所含喹諾酮類耐藥基因的方法體系,用于鑒定特異基因和喹諾酮類耐藥基因的引物均為首次使用。本研究成功的建立了多重PCR體系,該體系可快速高效的檢測鮑曼不動桿菌及其喹諾酮類耐藥基因。
【圖文】：

圖 2.1 PCR 法檢測鮑曼不動桿菌特異性Fig 2.1 Specificity of the PCR assay to identify Acinetobactor baumannii1 泳道為 DL DNA2000 marker；2-9 泳道為鮑曼不動桿菌臨床分離株；10 泳道為銅綠假單胞菌；11 泳道為肺炎克雷伯菌；12 泳道為大腸桿菌；13 泳道為志賀氏菌；14 泳道為陰性對照Lane 1 was DL2000 DNAmarker, the template of lane 2 to 9 were clinical isolates ofAcinetobacter Baumanii. From Lane 10 to 14 were Pseudomonas aeruginosa, Klebsiellapneumoniae, Escherichia coli, Shiga bacillus and negative control.LAMP 法鑒定體系的特異性評估在該法鑒定特異基因的實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用到的試驗(yàn)菌株與上述 PCR 法一樣，包括：162 株鮑曼不動桿菌菌株作為實(shí)驗(yàn)組，，肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌及志賀氏菌各一株作為對照組。由下圖可見，2-9 泳道均為鮑曼不動桿2.3.2

圖 2.2 LAMP 法檢測鮑曼不動桿菌特異性Fig2.2 Specificity of the LAMPassay to identify Acinetobactor baumannii1 泳道為 DL2000 marker；2-9 泳道為鮑曼不動桿菌臨床分離株；10 泳道為銅綠假單胞菌；11 泳道為肺炎克雷伯氏菌；12 泳道為大腸桿菌；13 泳道為志賀氏菌；14 泳道為陰性對照Lane 1 was DL2000 marker, the template of lane 2 to 9 were clinical isolates ofAcinetobacterBaumanii. From Lane 10 to 14 were Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,Escherichia coli, Shiga bacillus and negative control.PCR 法鑒定體系的靈敏度評估（1）以梯度稀釋后的陽性質(zhì)粒作為反應(yīng)的模板：經(jīng)由紫外分光光度計測出陽性質(zhì)粒的初始濃度為 175 ng/μL，根據(jù)上述質(zhì)粒個數(shù)計算公式計算出所提取的陽性質(zhì)粒的個數(shù)為 5.4×1010個/μL 。首先，取 102.3.3
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2703266