【摘要】：研究背景:小膠質細胞(microglia,MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)內的固有免疫細胞。MG是CNS穩(wěn)態(tài)的保護者,也是應對CNS微環(huán)境改變最早發(fā)生反應的細胞,能夠迅速進入活化狀態(tài)。活化的MG存在兩種功能和形態(tài)截然不同的極化類型,即促炎的M1型和抑炎的M2型�！敖�(jīng)典活化的”M1型MG通過分泌針對病原體和腫瘤細胞的促炎性細胞因子參與宿主防御過程,同時會造成組織和細胞的損傷;“替代活化的”M2型MG通過釋放抗炎性細胞因子減輕炎癥反應,并可通過產(chǎn)生修復相關因子參與損傷修復過程。正常情況下兩種極化類型之間存在著動態(tài)平衡,因此調控病理狀態(tài)下的MG極化狀態(tài)在控制CNS神經(jīng)炎癥方面十分重要。組織蛋白酶C(Cathepsin C,CatC),又稱二肽肽酶I(dipeptidase I,DPPI)是屬于番木瓜超家族的半胱氨酸蛋白酶,具有二肽肽酶活性,可通過活化絲氨酸蛋白酶,組織蛋白酶G和蛋白酶3等參與外周炎癥反應。同時,CatC在CNS表達及參與神經(jīng)炎癥性疾病也被逐步證實。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn),在LPS腹腔注射和促炎性因子誘導的神經(jīng)炎癥模型中,CatC高表達于活化的MG,并可以被分泌至細胞外,而且具有酶活性。隨后利用野生型、條件性CatC過表達和CatC敲減小鼠制備LPS誘導的神經(jīng)炎癥模型,發(fā)現(xiàn)CatC過表達加重神經(jīng)炎癥,而這一作用是通過促進MG向M1極化實現(xiàn)的。但是,CatC誘導MG向M1型極化的分子機制和相關信號轉導系統(tǒng)尚不清楚。研究目的:本文旨在闡明CatC促進MG向M1型極化的相關分子機制。這不僅可以進一步了解CatC的基因功能,并且為CNS神經(jīng)炎癥的治療提供新的靶點。研究方法:在本研究中,我們使用原代培養(yǎng)的MG,外源性給予CatC活性單體刺激,采用全基因表達譜微陣列分析的技術,篩選和分析相關差異表達的基因。從中選取NMDA受體亞基NR2B作為主要分子,采用q RT-PCR、流式細胞術和Western blot等技術探究分析了NR2B表達、NR2B介導的胞漿內鈣離子濃度改變以及鈣依賴的PKC/p38 MAPK/NF-κB信號轉導通路的激活情況。實驗結果以Mean±SEM表示,實驗數(shù)據(jù)采用t檢驗進行統(tǒng)計分析。p≤0.05為統(tǒng)計學意義的判定標準。結果:1.全基因組微陣列分析結果顯示,與未處理的原代培養(yǎng)的MG相比,CatC刺激的原代培養(yǎng)的MG內2組樣本中有254個差異表達基因,其中包括103個上調基因和151個下調基因。從中篩選出包括Grin2b在內的6個基因進一步進行q RT-PCR檢測,結果均顯示表達上調,并將Grin2b作為深入研究的分子。2.CatC的刺激增加了原代培養(yǎng)的MG和BV2細胞NR2B的m RNA和蛋白表達水平及其磷酸化水平;且在使用組織蛋白酶抑制劑E-64共刺激后,NR2B的表達水平降低。3.CatC刺激BV2細胞胞內Ca~(2+)濃度顯著增加;與E-64共刺激和使用NMDA抑制劑MK-801預處理后,BV2細胞內的Ca~(2+)水平均有一定程度的降低。4.CatC刺激原代培養(yǎng)的MG和BV2細胞內PKC的磷酸化水平增高,p-PKC/tPKC的比值顯著增高;給與E-64共刺激和MK-801預處理后,原代培養(yǎng)的MG和BV2細胞內PKC的磷酸化水平均降低。5.CatC刺激原代培養(yǎng)的MG和BV2細胞后,MAPKs/NF-κB信號通路上關鍵分子(p38,IκBα,p65)發(fā)生磷酸化,且磷酸化/非磷酸化比值顯著增高;在給與E-64共刺激和MK-801預處理后,CatC刺激的原代培養(yǎng)的MG和BV2細胞內p38,IκBα,p65的磷酸化水平均降低,且磷酸化/非磷酸化的比值也不同程度的降低。結論:CatC通過誘導MG中NR2B表達上調、胞漿內Ca~(2+)的濃度增高,激活Ca~(2+)依賴的PKC/p38 MAPK/NF-κB信號通路,促進MG向M1型極化。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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1 Xiao-Min Zhang;Jian-Hong Luo;;GluN2A versus GluN2B:twins,but quite different[J];Neuroscience Bulletin;2013年06期

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本文編號：2699414