【摘要】：目的:IL-29相較于I型干擾素其副作用更低,且同樣具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用,但因其特異性受體IFNLR1呈選擇性分布,故IL-29的臨床應(yīng)用范圍受限。本研究旨在驗(yàn)證人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HDMEC)上是否表達(dá)IL-29的特異性受體IFNLR1,以及探索IL-29與IFNLR1結(jié)合后在HDMEC細(xì)胞上所發(fā)揮的生物學(xué)作用。為IL-29的臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)選取HDMEC細(xì)胞培養(yǎng),應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HDMEC細(xì)胞上特異性受體IFNLR1的m RNA水平;應(yīng)用western blot和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)受體IFNLR1蛋白表達(dá)水平。(2)HDMEC細(xì)胞分為四組:(1)空白對(duì)照組(2)重組IL-29刺激組(3)應(yīng)用IFNLR1單克隆抗體封閉+重組IL-29刺激組(4)IFNLR1單克隆抗體的同源抗體Ig G+重組IL-29對(duì)照組。各組處理0.5小時(shí)、1小時(shí)及2小時(shí)后,ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-8和IL-12分泌水平。(3)DENV作用于HDMEC細(xì)胞,ELISA方法檢測(cè)24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)IL-29分泌量。(4)HDMEC細(xì)胞分為四組:(1)空白對(duì)照組(2)IFNLR1單克隆抗體封閉+DENV組(3)DENV組(4)IFNLR1單克隆抗體同源抗體Ig G+DENV組。通過Transwell建立單層HDMEC細(xì)胞模型,檢測(cè)各組HRP滲透到下室的OD值,以反映HDMEC細(xì)胞通透性。應(yīng)用pull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在DENV作用后,IFNLR1受體封閉前后Rho A的活化情況。結(jié)果:(1)通過real-time PCR技術(shù)從基因水平上檢測(cè)到HDMEC細(xì)胞表達(dá)IFNLR1,表達(dá)量為1.00±0.285;western blot和免疫熒光技術(shù)從蛋白水平證實(shí)HDMEC細(xì)胞表達(dá)IFNLR1。(2)IL-8在HDMEC細(xì)胞上有基礎(chǔ)分泌,在0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)分泌量分別為26.494±5.373pg/ml、33.60917±9.671 pg/ml、45.035±5.658 pg/ml;在重組IL-29刺激下,IL-8分泌量較空白組有所增加,在0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)分泌量分別為72.759±1.825 pg/ml、175.402±20.731 pg/ml、278.736±19.559 pg/ml;在封閉了IL-29特異性受體IFNLR1后再給予IL-29刺激,IL-8分泌量明顯降低,在0.5小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)分泌量分別為24.368±2.296 pg/ml、26.50574±12.232 pg/ml、32.36780±22.967 pg/ml;IFNLR1同源抗體Ig G組IL-8分泌量與僅IL-29處理組無(wú)明顯差異。HDMEC細(xì)胞在各組處理?xiàng)l件下,IL-12分泌量極低。(3)DENV作用后可以誘導(dǎo)HDMEC細(xì)胞分泌IL-29,在24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)分泌量分別為90.205±1.601pg/ml、179.949±13.241 pg/ml、153.821±5.356 pg/ml。(4)DENV作用于HDMEC細(xì)胞引起細(xì)胞通透性增加;封閉IFNLR1受體使HDMEC細(xì)胞通透性增加較僅DENV作用組更加明顯,在DENV作用后48小時(shí)通透性最大。(5)DENV作用于HDMEC細(xì)胞,可以使Rho A活化,Rho A活性增加;IFNLR1封閉后DENV引起Rho A活化量最多,Rho A活性最高。結(jié)論:(1)證實(shí)人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞上IFNLR1表達(dá);(2)IL-29與其特異性受體IFNLR1結(jié)合后能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-8的分泌,但不能誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)IL-12的分泌;(3)DENV感染HDMEC后誘導(dǎo)IL-29分泌,IL-29與特異性受體IFNLR1結(jié)合后對(duì)Rho A的活性有影響,Rho A的活性可能對(duì)血管通透性產(chǎn)生一定影響。
【圖文】：

抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用；而結(jié)構(gòu)上與 IL-10 家族成員相似。雖然Ⅰ型和Ⅲ型干擾素在基因表達(dá)和信號(hào)通路上基本相同，但是這兩種干擾素卻是通過完全不同的干擾素受體來(lái)發(fā)揮作用。干擾素家族受體，一般作為異物二聚體的形式存在。干擾素家族受體有 R1 和 R2 兩個(gè)受體鏈，R1 受體鏈的特異性較強(qiáng)是因?yàn)樗Y(jié)構(gòu)域長(zhǎng)，可以磷酸化，并且征集各類化學(xué)分子，從而決定細(xì)胞因子的特異性。相對(duì)而言 R2 受體鏈就沒有特異性，因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)域短，，只能征集其他酪氨酸殘基到受體復(fù)合物上，從而對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到一定的支持作用[3-5]。Ⅲ 型 干 擾 素 的 異 物二 聚 體 型 受 體 由 干擾 素 λ 受 體 1 （ Interferon λReceptor1,IFNLR1）的R1型受體鏈和白介素10R2受體（Interleukin-10 Receptor2IL10R2）的R2型受體鏈組成（圖1），主要由特異性受體IFNLR1發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)IL10R2，同時(shí)也是IL-10、IL-22和IL-26的R2型受體鏈[1]。

EC 細(xì)胞上 IFNLR1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量用RT-qPCR 方法檢測(cè)兩個(gè)細(xì)胞株 HDMEC 和HepG2上 I結(jié)果如下表 1.1。HDMEC 細(xì)胞和 HepG2 細(xì)胞上 IFNLR1.00±0.285 和 9.14±0.36，HDMEC 上的表達(dá)量顯著低于 Hep表 1.1，圖 1.1）表 1.1 HDMEC、HepG2 細(xì)胞上 IFNLR1mRNA 相對(duì)表達(dá)量細(xì)胞 IFNLR1 mRNA 相對(duì)表HDMEC 1.00±0.285HepG2 9.14±0.36**注：n=3， X±SD， **表示與 HepG2 相比，p<0.01**
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2699390