【摘要】：目的探究在骨髓譜系細(xì)胞中特異性敲除膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(Ferroportin,Fpn)對細(xì)胞鐵代謝的影響以及對破骨細(xì)胞分化與功能的作用機制。方法在哺乳動物細(xì)胞中,膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白是目前唯一確定的能夠排出細(xì)胞鐵的通道蛋白,也被稱為Scl40a1。本課題研究組使用Slc40a1-floxed基因突變小鼠(購自Jackson實驗動物中心),與溶菌酶M-Cre基因小鼠雜交繁育,產(chǎn)生一種在骨髓譜系細(xì)胞中特異性敲除Fpn基因的小鼠品系。將基因型為Fpn-flox/flox;Cre/+的小鼠命名為髓系Fpn基因敲除小鼠(Fpn~(ΔLysM)),即實驗組,將雜交繁育產(chǎn)生的Fpn-+/+;Cre/+的同窩小鼠作為對照組(control)。通過微計算機斷層掃描技術(shù)分析比較兩組小鼠長骨及椎骨的皮質(zhì)骨與松質(zhì)骨是否有差異,并通過組織學(xué)與骨組織形態(tài)計量學(xué)進(jìn)一步檢測兩組小鼠的破骨細(xì)胞數(shù)量與骨小梁量,證實其結(jié)果可靠性。另一方面通過血清I型原膠原N端前肽酶聯(lián)免疫法測定,明確成骨細(xì)胞對兩組小鼠骨量差異是否有影響。為了明確在骨髓譜系細(xì)胞中膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的缺失對鐵代謝是否有影響,本實驗測定了兩組小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中鐵的攝入量。為了進(jìn)一步明確細(xì)胞中鐵量的改變對破骨細(xì)胞分化及功能的影響,本實驗將兩組小鼠的骨髓巨噬細(xì)胞分別培養(yǎng)在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板與骨片上,并誘導(dǎo)其向破骨細(xì)胞分化,獲得骨髓巨噬細(xì)胞,破骨細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟的破骨細(xì)胞三種細(xì)胞,通過抗酒石酸酸性磷酸酶染色,觀察兩組小鼠三種細(xì)胞在不同環(huán)境條件下,細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的差異情況。還通過實時熒光定量PCR檢測比較兩組小鼠破骨細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量的變化,應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測破骨細(xì)胞在形成分化過程中的相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平。本實驗還進(jìn)行了流式細(xì)胞技術(shù)測定及細(xì)胞凋亡酶聯(lián)免疫吸附測定,明確兩組小鼠細(xì)胞間有無增殖周期變化及細(xì)胞存活差異。為了找出是何種細(xì)胞調(diào)控機制影響了破骨細(xì)胞的形成及分化,本課題組還對破骨細(xì)胞形成過程中的兩種重要細(xì)胞因子的相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)免疫印跡檢測,試圖明確能夠起到調(diào)控作用的細(xì)胞通路。結(jié)果在骨髓譜系細(xì)胞中特異性敲除膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白會促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成并導(dǎo)致雌性小鼠的骨量降低,但對成骨細(xì)胞的骨形成作用無明顯影響。體外實驗研究表明,膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白的缺失還會導(dǎo)致細(xì)胞鐵含量輕度增加,促進(jìn)骨髓巨噬細(xì)胞增殖,并增強了NFATc1和PGC-1β(兩種對破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子)的表達(dá),但對破骨細(xì)胞的功能及其存活無明顯影響。結(jié)論在骨髓譜系細(xì)胞中特異性敲除膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白,會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵蓄積,促進(jìn)骨髓巨噬細(xì)胞增殖及破骨細(xì)胞形成,導(dǎo)致雌性小鼠的骨量降低。由此可見,由膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)的鐵含量水平對破骨細(xì)胞的形成和骨量的平衡是至關(guān)重要的。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

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本文編號：2697756