【摘要】：目的:構(gòu)建體外DENV-2感染BHK、Raw264.7細(xì)胞模型,探討白紋伊蚊唾液重組34k-2蛋白(r Alb-34k2)在DENV-2感染BHK、Raw264.7細(xì)胞中可能的調(diào)控作用。方法:1)利用RTCA技術(shù)實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)對(duì)BHK和Raw264.7細(xì)胞增殖的影響及其對(duì)不同MOI的DENV-2感染引發(fā)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的調(diào)控作用;2)利用q RT-PCR法比較不同MOI感染模型下r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)干預(yù)組與病毒對(duì)照組、熱滅活蛋白組、特異性抗體阻斷組之間BHK和Raw264.7細(xì)胞胞內(nèi)病毒NS5基因的表達(dá)差異;3)檢測(cè)不同TCID50滴度下DENV-2感染BHK細(xì)胞的半數(shù)細(xì)胞指數(shù)時(shí)間(CIT50),構(gòu)建CIT50-TCID50回歸方程,并利用該方程檢測(cè)BHK細(xì)胞感染模型中細(xì)胞培養(yǎng)上清中的DENV-2滴度;4)利用q RT-PCR法分析r Alb-34k2蛋白(1μg/ml)對(duì)感染前后18h內(nèi)Raw264.7細(xì)胞IFN-β/γ、IL-1β、TNF-α、IL-10、CXCL2及CXCL10的m RNA表達(dá)差異的影響。結(jié)果:1)RTCA結(jié)果顯示r Alb-34k2蛋白(10μg/ml、1μg/ml)對(duì)BHK細(xì)胞、Raw264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響;2)在DENV-2感染BHK細(xì)胞(MOI=0.01、0.005)、Raw264.7細(xì)胞(MOI=5、10)時(shí),各濃度r Alb-34k2蛋白干預(yù)組均引起相應(yīng)細(xì)胞增殖曲線左移增加,其中以高濃度蛋白干預(yù)組(10μg/ml)引起B(yǎng)HK細(xì)胞CIT50顯著縮短(P0.05)、Raw264.7細(xì)胞最大CI值(CImax)下降、第45小時(shí)的CI值(CI45)顯著縮短(P0.05);3)胞內(nèi)DENV-2 NS5核酸檢測(cè)顯示:在r Alb-34k2蛋白干預(yù)后,BHK細(xì)胞、Raw264.7細(xì)胞早期胞內(nèi)病毒核酸表達(dá)量均較病毒對(duì)照組增高;在BHK細(xì)胞中,以高濃度蛋白(10μg/ml)干預(yù)組升高顯著,MOI=1時(shí),分別為對(duì)照組的2.68倍(12h,P0.01)、3.63倍(24h,P0.01)、1.62倍(48h,P0.05);MOI=0.5時(shí),為對(duì)照組的3.78倍(12h,P0.01);在Raw264.7細(xì)胞中,蛋白干預(yù)組(10μg/ml)分別為病毒感染組(MOI=5)的5.2倍(6h,P0.01)、3.5倍(12h,P0.05);且滅活r Alb-34k2蛋白組、特異性抗體阻斷組均與病毒對(duì)照組無(wú)差異;4)構(gòu)建RTCA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-7.007x+75.546(R2=0.9854);檢測(cè)病毒含量(log TCID50/ml)的有效性和靈敏度比較:RTCA標(biāo)曲法為4.90±0.05(D2)、6.27±0.15(D3)、5.99±0.17(D4),傳統(tǒng)TCID50法為6.48±0.11(D3)、5.63±0.08(D4),兩種方法檢測(cè)的病毒滴度無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(P0.05),但以RTCA標(biāo)曲法更為靈敏。在BHK細(xì)胞感染模型中:感染第48h蛋白干預(yù)組上清中活病毒水平明顯低于病毒對(duì)照組(P0.05);5)r Alb-34k2蛋白對(duì)感染前后Raw264.7細(xì)胞表達(dá)IFN-β、IFN-γ、TNF-α無(wú)影響;但可能上調(diào)感染前Raw264.7細(xì)胞IL-10、抑制CXCL10表達(dá);并在感染后可能參與抑制IL-1β、CXCL2表達(dá)的過(guò)程。結(jié)論:1)r Alb-34k2蛋白可促進(jìn)DENV-2在BHK細(xì)胞中早期增殖,并參與調(diào)控病毒的釋放;2)r Alb-34k2蛋白可促進(jìn)DENV-2在Raw264.7細(xì)胞中早期增殖;3)構(gòu)建的CIT50-TCID50標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于檢測(cè)DENV-2的病毒滴度且靈敏度較傳統(tǒng)TCID50法高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為深入探討白紋伊蚊唾液34k2蛋白在DENV-2感染靶細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

果rAlb-34k2 蛋白對(duì) BHK 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 BHK 細(xì)胞最佳接種密度及血清維持濃度檢測(cè)最佳細(xì)胞初種濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：10000 cells/孔和 20000 cells/孔組曲線相似，于接種后 2-4h 進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10-12h 達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，持時(shí)間約為 50h 左右，而 40000 cells/孔組生長(zhǎng)較快，平臺(tái)期維持時(shí)間為（圖 1-1）；同時(shí)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：以 20000cells/孔接種細(xì)胞在培養(yǎng)第胞呈均勻單層，第 40-60 小時(shí)細(xì)胞呈致密單層，，無(wú)顯著聚集疊加現(xiàn)象。以 20000 cells/孔 BHK 細(xì)胞進(jìn)行血清濃度篩選發(fā)現(xiàn)：無(wú)血清組及 10%F維持時(shí)間短于低濃度血清組，而以 2%FBS 組 CI 值變化平緩，維持時(shí)00h 以上（圖 1-2）；顯微鏡觀察提示在同時(shí)期 5%FBS 組細(xì)胞增殖明顯胞聚集疊加現(xiàn)象顯著。

以 20000 cells/孔 BHK 細(xì)胞進(jìn)行血清濃度篩選發(fā)現(xiàn)：無(wú)血清組及 10%F維持時(shí)間短于低濃度血清組，而以 2%FBS 組 CI 值變化平緩，維持時(shí)00h 以上（圖 1-2）；顯微鏡觀察提示在同時(shí)期 5%FBS 組細(xì)胞增殖明顯胞聚集疊加現(xiàn)象顯著。圖 1-1 BHK 細(xì)胞增殖曲線Fig. 1-1 The BHK proliferation curve
【學(xué)位授予單位】：貴州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 李方站;程金芝;王濤;牟小會(huì);顏鳳;翟慧;吳家紅;;白紋伊蚊唾液腺34 ku-2基因克隆與原核表達(dá)[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2015年02期

2 龔道方;周紅寧;;中國(guó)登革熱重要媒介白紋伊蚊的研究進(jìn)展[J];中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志;2009年06期

3 吳家紅;;蚊蟲唾液組分的抗凝血活性及其對(duì)宿主的免疫調(diào)控作用[J];中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志;2008年05期

本文編號(hào)：2697487