【摘要】：目的越來越多的證據(jù)表明,雌激素是影響良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)和前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn),在前列腺間質細胞WPMY-1中,前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)能夠通過上調雌激素相關受體a(Estrogen-related receptor alpha, ERRa)的表達進而促進芳香化酶的轉錄,由此導致雌二醇(17β-estradiol, E2)濃度的增加。其中芳香化酶是催化睪酮轉化為E2的限速酶。提示,前列腺中PGE2在促進E2的生成中發(fā)揮重要的作用。ERRα作為第一個被發(fā)現(xiàn)的孤兒核受體,至今仍未發(fā)現(xiàn)其天然配體,而且對其轉錄活性的調節(jié)機制也尚不明確。本論文第一部分首次發(fā)現(xiàn)了PGE2能夠激活ERRa的轉錄活性,并進而促進芳香化酶的表達和E2的生成。在實驗室之前的研究中,我們構建了大鼠BPH模型,并使用激光顯微切割聯(lián)合表達譜基因芯片的方法研究單一類型細胞在BPH不同階段的基因表達,發(fā)現(xiàn)早期生長反應基因-1(Early Growth Response Gene-1,EGR-1)在BPH進程中一直高表達,并且在BPH早期的上皮細胞中上調最為明顯,提示EGR-1在大鼠BPH進程尤其是BPH的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。EGR-1被發(fā)現(xiàn)為PCa發(fā)病關鍵節(jié)點基因之一,然而還尚未有報道其在BPH中的作用。本文第二部分研究了雌激素效應基因EGR-1在BPH中的生物學功能以及雌激素對EGR-1及其下游基因的調節(jié)機制。這些工作為闡明雌激素生成及其影響B(tài)PH進程的分子機制提供一些實驗依據(jù)。 第一部分PGE2通過激活ERRa轉錄活性上調前列腺間質細胞中芳香化酶的表達 方法在WPMY-1細胞中轉染ERRa表達質粒并添加PGE2,通過雙熒光素酶活性方法檢測ERRa反應元件(ERRa response element,ERRE)報告基因的轉錄。轉染ERRa表達質�；騭iRNA并添加PGE2, Real-time RT-PCR和Western blot檢測芳香化酶的表達。在WPMY-1細胞中添加PGE2,使用熒光成像和Western blot檢測ERRa蛋白胞內分布情況。在WPMY-1細胞和穩(wěn)定轉染ERRa表達質粒的WPMY-1細胞中分別添加PGE2、PGE2受體(PGE2receptor,EP)2拮抗劑AH6809、EP3拮抗劑L798106、EP4拮抗劑AH23848、EP2激動劑Butaprost、EP3激動劑Sulprostone、EP4激動劑Cay10580、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)抑制劑LY294002、細胞外調節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)抑制劑U0126以及環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)激活劑Forskolin,檢測細胞中芳香化酶以及ERRE報告基因的表達。在WPMY-1細胞中分別添加PGE2、Butaprost、Cay10580、 Forskolin、LY294002和U0126,Western blot檢測p-ERK及ERK的表達。在WPMY-1細胞中轉染ERRα表達質粒并分別添加PGE2、LY294002和U0126,使用免疫共沉淀(Immunopreciptation,IP)及磷酸化蛋白染色的方法檢測p-ERRα的表達。 結果無血清培養(yǎng)條件下,過表達ERRα并不影響ERRE報告基因和芳香化酶的表達,而當加入PGE2后,上調作用即顯現(xiàn)。特異性siRNA沉默ERRα表達后,PGE2對芳香化酶的上調作用消失。PGE2能夠促進ERRα核轉移。在WPMY-1細胞和穩(wěn)定轉染ERRα表達質粒的WPMY-1細胞中單獨加入EP拮抗劑AH6809,L798106或者AH23848并不能抑制PGE2對芳香化酶的上調效應,只有同時使用AH6809和AH23848才能抑制該效應；Butaprost、Cay10580和Forskolin能夠上調ERRE報告基因和芳香化酶的表達；LY294002和U0126能夠抑制PGE2、Butaprost、Cay10580和Forskolin對ERRE報告基因和芳香化酶的上調效應。LY294002和U0126能夠抑制PGE2、Butaprost、Cay10580和Forskolin對ERK的磷酸化。LY294002和U0126能夠抑制PGE2對ERRa的磷酸化。 結論PGE2能夠激活EP2/EP4-PI3K-ERK信號通路,通過增加ERRα磷酸化以及促進ERRα核轉運激活ERRα轉錄活性,進而上調ERRα靶基因芳香化酶的表達。 第二部分雌激素效應基因EGR-1促進前列腺增生上皮細胞系BPH-1的增殖 方法Real-time RT-PCR檢測大鼠BPH組織中EGR-1表達。免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)方法檢測人BPH組織中EGR-1的表達。Real-time RT-PCR檢測人前列腺上皮細胞系RWPE-1及BPH-1中EGR-1表達。穩(wěn)定轉染構建EGR-1過表達BPH-1細胞系并使用Real-time RT-PCR和Western blot鑒定。MTT檢測EGR-1過表達BPH-1細胞系增殖水平；向BPH-1細胞中轉染EGR-1siRNA并使用MTT檢測其增殖水平；收集EGR-1過表達BPH-1細胞系的條件培養(yǎng)液(conditioned medium, CM)處理WPMY-1細胞,使用MTT檢測WPMY-1細胞增殖水平。在BPH-1細胞中添加E2,使用免疫細胞化學(immunocytochemistry, ICC)及Western blot檢測EGR-1蛋白胞內分布。Real-time RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附反應(enzyme linked-immuno-sorbent assay, Elisa)檢測EGR-1過表達以及siRNA、E2處理的BPH-1細胞中轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)和胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor2, IGF2)的表達。Real-time RT-PCR檢測EGR-1過表達BPH-1細胞系中前列腺素E合酶(prostaglandin E synthase, PTGES)和前列腺素內過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase1, PTGS1)的表達。 結果EGR-1在大鼠BPH組織、人BPH組織中以及BPH-1細胞系中表達增強。EGR-1過表達的BPH-1細胞增殖水平升高；特異性siRNA沉默EGR-1表達后BPH-1細胞增殖水平降低；EGR-1過表達BPH-1細胞的CM能夠促進WPMY-1細胞增殖。E2能夠促進EGR-1核遷移。過表達EGR-1后IGF2和TGFβ1表達水平增加；E2能夠上調IGF2和TGFβ1的表達,而將EGR-1敲除后,該上調效果消失。過表達EGR-1后PTGES和PTGS1表達增加。 結論在大鼠及人BPH組織中EGR-1表達增強；EGR-1能夠促進前列腺上皮細胞的增殖,還能通過旁分泌作用促進間質細胞的增殖；E2能夠促進BPH-1細胞中EGR-1蛋白的核遷移進而激活其轉錄活性,而且EGR-1介導了E2對IGF2和TGFβ1的調控。
【圖文】：

圖1.2前列腺中的雌激素效應1. 1.3 ERR a在前列腺疾病中的作用1.1.3.1 ERR a研究現(xiàn)狀雌激素相關受體a (Estrogen-related receptor alpha, ERRa)屬于核受體超族，是第一個被發(fā)現(xiàn)的孤兒核受體，孤兒核受體是指沒有天然配體的一類受[76]。ERRa 和 ERRP 是 1988 年由 Vincent Giguere 發(fā)現(xiàn)，以 ERa DNA 結合區(qū)(DNA-binding domain, DBD)的保守序列為探針蹄選到的兩個新基因[77]，列分析表明其與ERs有很強的同源性，所以命名為ERRs，目前該家族有ERRa、ERRP和ERRy三個成員。人ERRa蛋白由423個氨基酸組成，其編碼基因位染色體llql3位點；ERR(3蛋白由500個氨基酸組成，其編碼基因位于染色14q243位點；ERRy蛋白由458個氨基酸組成，其編碼基因位于染色體lq41位點178】。三種ERRs蛋白的DBD和配體結合區(qū)域（ligand-binding domain, LBD)

圖1.3 ERs和ERRs蛋白的DBD和LBD同源性分析三種ERRs在組織分布上有特異性。ERRa的表達范圍較廣，在胚胎期和成體組織中均能檢測到ERRa的表達，如胎盤尿囊紙膜，發(fā)育中的腎臟、心肌、消化道、骨豁、泌尿生殖器上皮、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)、和褐色脂肪組織，以及成體中的心、腦、骨豁肌、腎、睪丸肝、肺、陰道等【77，8_]。ERRP的表達水平相對較低，最早也在胚胎期就被檢測到，但也只在最后發(fā)育成域毛膜的細胞中表達，ERRP在成年大鼠的腎臟、心臟、睪丸、腦、前列腺等組織中可檢測到，另外在成年小鼠的腎臟和心臟中有微弱表達，，ERRP在個體發(fā)育中也發(fā)揮重要作用，ERR卩的敲除的大鼠會由于晶胚發(fā)育障礙而死亡[82_84】。ERRy在胚胎期的大腦中高表達，在腎臟和肺中也有表達，在多種成體組織如心、腦、胎盤、骨路肌、腎、胰腺、腎上腺、甲狀腺、氣管、脊髓、視網(wǎng)膜、前列腺、睪丸、小腸中都可見其表達[85’86]。1. 1.3. 2 ERR a的表達調控
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R33

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 ;第九屆國際芳香化酶大會通知[J];中華乳腺病雜志(電子版);2008年03期

2 沈凌;李占魁;;腦芳香化酶的表達特點及其生物學意義[J];實用兒科臨床雜志;2006年22期

3 陸勁松;李鶴成;曹道成;狄根紅;吳炅;沈坤煒;韓企夏;沈鎮(zhèn)宙;邵志敏;;芳香化酶表達在淋巴結陰性乳腺癌中的預后價值[J];復旦學報(醫(yī)學版);2007年04期

4 張吉強,蔡文琴;芳香化酶在腦和腫瘤中的表達、調控與意義[J];解剖科學進展;1999年04期

5 胡榮,陳宗濤;芳香化酶在腦中的分布及其細胞定位[J];神經(jīng)解剖學雜志;2000年04期

6 張薏,魏麗惠;芳香化酶及其抑制劑在婦科腫瘤方面的研究[J];中國婦產(chǎn)科臨床;2001年01期

7 肖嵐,蔡文琴;芳香化酶與腦的發(fā)育和再生的相關性[J];解剖科學進展;2002年01期

8 田寶民;張英懷;賈志宇;;芳香化酶在涎腺黏液表皮樣癌組織中的表達及意義[J];第三軍醫(yī)大學學報;2010年04期

9 付靜;沈中華;程飛雄;劉桂霞;李衛(wèi)華;唐峗;;芳香化酶的結構、催化機制及其抑制劑研究進展[J];藥學學報;2012年01期

10 馬曉欣;王丹波;金英楠;張淑蘭;陸景明;矢內原巧;;白介素1β與地塞米松聯(lián)合應用對人成骨細胞芳香化酶活性的影響[J];中國醫(yī)科大學學報;2006年05期

相關會議論文 前10條

1 巴文君;張秋菊;孫麗萍;;芳香化酶的研究進展[A];中醫(yī)藥生物化學與分子生物學通訊[C];2008年

2 王凌;李大金;王文君;朱影;;脫氫表雄酮對鼠成骨細胞芳香化酶和雌激素受體亞型轉錄的調控作用[A];首屆滬浙婦產(chǎn)科學術論壇暨2006年浙江省婦產(chǎn)科學學術年會論文匯編[C];2006年

3 張揚;張利紅;張為民;;黃鱔腦型P450芳香化酶的cDNA克隆和表達[A];第二屆中國動物學會比較內分泌學分會和發(fā)育生物學分會聯(lián)合學術研討會論文集[C];2005年

4 張林西;李海軍;金春亭;李玉珍;范婕;武欣;白美玲;;芳香化酶在乳腺癌組織中的表達[A];中華醫(yī)學會病理學分會2006年學術年會論文匯編[C];2006年

5 丁小文;楊紅健;鄒德宏;俞洋;孟旭莉;;新輔助化療對乳腺癌組織芳香化酶的影響[A];2006浙江省乳腺癌治療新進展學習班暨浙江省抗癌協(xié)會乳腺癌專委會學術年會會議資料[C];2006年

6 翁強;張夢遠;張浩林;坪田敏男;渡邊元;田谷一善;;野生貉(Nyctereutes procyonoides)卵巢內細胞色素P450芳香化酶的免疫定位和其mRNA的表達[A];第一屆中華醫(yī)學會生殖醫(yī)學分會、中國動物學會生殖生物學分會聯(lián)合年會論文匯編[C];2007年

7 王凌;李大金;王文君;朱影;;脫氫表雄酮對鼠成骨細胞芳香化酶和雌激素受體亞型轉錄的調控作用[A];首屆滬浙婦產(chǎn)科學術論壇暨2006年浙江省婦產(chǎn)科學學術年會論文匯編[C];2006年

8 黃潔明;許麗綿;歐陽惠卿;胡斌;;羅氏內異方對內異癥大鼠模型異位內膜芳香化酶表達的影響[A];第九次全國中醫(yī)婦科學術大會論文集[C];2009年

9 袁鷹;魯梅芳;王蓁;;肥胖并子宮內膜癌病人腹部脂肪組織芳香化酶mRNA的表達[A];全國首屆代謝綜合征的基礎與臨床專題學術會議論文匯編[C];2004年

10 張樂鳴;;芳香化酶抑制在乳腺癌治療中的若干問題[A];2006浙江省乳腺癌治療新進展學習班暨浙江省抗癌協(xié)會乳腺癌專委會學術年會會議資料[C];2006年

相關重要報紙文章 前6條

1 何偉;月經(jīng)為何不“如期而至”[N];中國人口報;2006年

2 ;女性如何關愛卵巢[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2008年

3 本報記者 白軼南;舍不得“口�！狈啦蛔∪榘N];保健時報;2004年

4 本報記者 張偉;夏天并不是乳腺癌的高發(fā)期[N];健康時報;2004年

5 保健時報實習記者 常華;胖大姐“絕經(jīng)”后提防乳腺癌[N];保健時報;2006年

6 鄧榮沙 董愛娥;亦功亦過雌激素[N];上海中醫(yī)藥報;2007年

相關博士學位論文 前5條

1 王紹光;異位內膜間質細胞芳香化酶、凋亡信號通路和侵蝕性生長的研究[D];山東大學;2004年

2 趙學英;子宮內膜異位癥細胞芳香化酶的表達與芳香化酶抑制劑對細胞凋亡的調節(jié)及子宮內膜異位癥的蛋白指紋圖譜研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2004年

3 賀斌;一、芳香化酶基因多態(tài)性和十一酸睪酮藥物避孕差異相關性的研究 二、利用米非司酮藥物建立小鼠子宮出血模型的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2006年

4 寧召臣;PGE2對芳香化酶的調節(jié)機制及雌激素效應基因EGR-1功能研究[D];南開大學;2014年

5 苗琳;PGE2調節(jié)前列腺中芳香化酶和鈣結合蛋白S100A8分子機制的研究[D];南開大學;2010年

相關碩士學位論文 前10條

1 洪波;生理周期及致癇后雌性大鼠海馬細胞色素P450芳香化酶的動態(tài)表達[D];復旦大學;2009年

2 田寶民;涎腺粘液表皮樣癌組織中芳香化酶與增殖細胞核抗原的表達及相互關系[D];河北醫(yī)科大學;2005年

3 沈黎明;甘草提取物中芳香化酶小分子配體的發(fā)現(xiàn)及其芳香化酶抑制活性研究[D];浙江大學;2011年

4 王曉彩;芳香化酶、雌激素受體、孕激素受體在漿液性上皮性卵巢腫瘤中的表達及意義[D];中國醫(yī)科大學;2004年

5 李文金;乳腺癌芳香化酶表達與臨床病理因素的關系[D];蘇州大學;2007年

6 邱麗貞;芳香化酶在乳腺的癌前病變組織中的表達意義[D];吉林大學;2009年

7 王婉;芳香化酶在乳腺癌及增生性病變組織中的表達及意義[D];吉林大學;2008年

8 鄭潔;人精子中芳香化酶表達與精子功能的關系[D];四川大學;2005年

9 田君;PCOS模型大鼠P450芳香化酶表達的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2008年

10 董德梅;草魚腦芳香化酶的cDNA克隆、啟動子分離與轉錄活性的調控[D];電子科技大學;2009年

本文編號：2696970