【摘要】：目的越來越多的證據(jù)表明,雌激素是影響良性前列腺增生(Benign Prostatic Hyperplasia,BPH)和前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn),在前列腺間質(zhì)細胞WPMY-1中,前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)能夠通過上調(diào)雌激素相關(guān)受體a(Estrogen-related receptor alpha, ERRa)的表達進而促進芳香化酶的轉(zhuǎn)錄,由此導致雌二醇(17β-estradiol, E2)濃度的增加。其中芳香化酶是催化睪酮轉(zhuǎn)化為E2的限速酶。提示,前列腺中PGE2在促進E2的生成中發(fā)揮重要的作用。ERRα作為第一個被發(fā)現(xiàn)的孤兒核受體,至今仍未發(fā)現(xiàn)其天然配體,而且對其轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)機制也尚不明確。本論文第一部分首次發(fā)現(xiàn)了PGE2能夠激活ERRa的轉(zhuǎn)錄活性,并進而促進芳香化酶的表達和E2的生成。在實驗室之前的研究中,我們構(gòu)建了大鼠BPH模型,并使用激光顯微切割聯(lián)合表達譜基因芯片的方法研究單一類型細胞在BPH不同階段的基因表達,發(fā)現(xiàn)早期生長反應(yīng)基因-1(Early Growth Response Gene-1,EGR-1)在BPH進程中一直高表達,并且在BPH早期的上皮細胞中上調(diào)最為明顯,提示EGR-1在大鼠BPH進程尤其是BPH的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。EGR-1被發(fā)現(xiàn)為PCa發(fā)病關(guān)鍵節(jié)點基因之一,然而還尚未有報道其在BPH中的作用。本文第二部分研究了雌激素效應(yīng)基因EGR-1在BPH中的生物學功能以及雌激素對EGR-1及其下游基因的調(diào)節(jié)機制。這些工作為闡明雌激素生成及其影響B(tài)PH進程的分子機制提供一些實驗依據(jù)。 第一部分PGE2通過激活ERRa轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)前列腺間質(zhì)細胞中芳香化酶的表達 方法在WPMY-1細胞中轉(zhuǎn)染ERRa表達質(zhì)粒并添加PGE2,通過雙熒光素酶活性方法檢測ERRa反應(yīng)元件(ERRa response element,ERRE)報告基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)染ERRa表達質(zhì)�；騭iRNA并添加PGE2, Real-time RT-PCR和Western blot檢測芳香化酶的表達。在WPMY-1細胞中添加PGE2,使用熒光成像和Western blot檢測ERRa蛋白胞內(nèi)分布情況。在WPMY-1細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERRa表達質(zhì)粒的WPMY-1細胞中分別添加PGE2、PGE2受體(PGE2receptor,EP)2拮抗劑AH6809、EP3拮抗劑L798106、EP4拮抗劑AH23848、EP2激動劑Butaprost、EP3激動劑Sulprostone、EP4激動劑Cay10580、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide-3-kinase, PI3K)抑制劑LY294002、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)抑制劑U0126以及環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)激活劑Forskolin,檢測細胞中芳香化酶以及ERRE報告基因的表達。在WPMY-1細胞中分別添加PGE2、Butaprost、Cay10580、 Forskolin、LY294002和U0126,Western blot檢測p-ERK及ERK的表達。在WPMY-1細胞中轉(zhuǎn)染ERRα表達質(zhì)粒并分別添加PGE2、LY294002和U0126,使用免疫共沉淀(Immunopreciptation,IP)及磷酸化蛋白染色的方法檢測p-ERRα的表達。 結(jié)果無血清培養(yǎng)條件下,過表達ERRα并不影響ERRE報告基因和芳香化酶的表達,而當加入PGE2后,上調(diào)作用即顯現(xiàn)。特異性siRNA沉默ERRα表達后,PGE2對芳香化酶的上調(diào)作用消失。PGE2能夠促進ERRα核轉(zhuǎn)移。在WPMY-1細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ERRα表達質(zhì)粒的WPMY-1細胞中單獨加入EP拮抗劑AH6809,L798106或者AH23848并不能抑制PGE2對芳香化酶的上調(diào)效應(yīng),只有同時使用AH6809和AH23848才能抑制該效應(yīng)；Butaprost、Cay10580和Forskolin能夠上調(diào)ERRE報告基因和芳香化酶的表達；LY294002和U0126能夠抑制PGE2、Butaprost、Cay10580和Forskolin對ERRE報告基因和芳香化酶的上調(diào)效應(yīng)。LY294002和U0126能夠抑制PGE2、Butaprost、Cay10580和Forskolin對ERK的磷酸化。LY294002和U0126能夠抑制PGE2對ERRa的磷酸化。 結(jié)論PGE2能夠激活EP2/EP4-PI3K-ERK信號通路,通過增加ERRα磷酸化以及促進ERRα核轉(zhuǎn)運激活ERRα轉(zhuǎn)錄活性,進而上調(diào)ERRα靶基因芳香化酶的表達。 第二部分雌激素效應(yīng)基因EGR-1促進前列腺增生上皮細胞系BPH-1的增殖 方法Real-time RT-PCR檢測大鼠BPH組織中EGR-1表達。免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)方法檢測人BPH組織中EGR-1的表達。Real-time RT-PCR檢測人前列腺上皮細胞系RWPE-1及BPH-1中EGR-1表達。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染構(gòu)建EGR-1過表達BPH-1細胞系并使用Real-time RT-PCR和Western blot鑒定。MTT檢測EGR-1過表達BPH-1細胞系增殖水平；向BPH-1細胞中轉(zhuǎn)染EGR-1siRNA并使用MTT檢測其增殖水平；收集EGR-1過表達BPH-1細胞系的條件培養(yǎng)液(conditioned medium, CM)處理WPMY-1細胞,使用MTT檢測WPMY-1細胞增殖水平。在BPH-1細胞中添加E2,使用免疫細胞化學(immunocytochemistry, ICC)及Western blot檢測EGR-1蛋白胞內(nèi)分布。Real-time RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme linked-immuno-sorbent assay, Elisa)檢測EGR-1過表達以及siRNA、E2處理的BPH-1細胞中轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)和胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor2, IGF2)的表達。Real-time RT-PCR檢測EGR-1過表達BPH-1細胞系中前列腺素E合酶(prostaglandin E synthase, PTGES)和前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase1, PTGS1)的表達。 結(jié)果EGR-1在大鼠BPH組織、人BPH組織中以及BPH-1細胞系中表達增強。EGR-1過表達的BPH-1細胞增殖水平升高；特異性siRNA沉默EGR-1表達后BPH-1細胞增殖水平降低；EGR-1過表達BPH-1細胞的CM能夠促進WPMY-1細胞增殖。E2能夠促進EGR-1核遷移。過表達EGR-1后IGF2和TGFβ1表達水平增加；E2能夠上調(diào)IGF2和TGFβ1的表達,而將EGR-1敲除后,該上調(diào)效果消失。過表達EGR-1后PTGES和PTGS1表達增加。 結(jié)論在大鼠及人BPH組織中EGR-1表達增強；EGR-1能夠促進前列腺上皮細胞的增殖,還能通過旁分泌作用促進間質(zhì)細胞的增殖；E2能夠促進BPH-1細胞中EGR-1蛋白的核遷移進而激活其轉(zhuǎn)錄活性,而且EGR-1介導了E2對IGF2和TGFβ1的調(diào)控。
【圖文】：

圖1.2前列腺中的雌激素效應(yīng)1. 1.3 ERR a在前列腺疾病中的作用1.1.3.1 ERR a研究現(xiàn)狀雌激素相關(guān)受體a (Estrogen-related receptor alpha, ERRa)屬于核受體超族，是第一個被發(fā)現(xiàn)的孤兒核受體，孤兒核受體是指沒有天然配體的一類受[76]。ERRa 和 ERRP 是 1988 年由 Vincent Giguere 發(fā)現(xiàn)，以 ERa DNA 結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain, DBD)的保守序列為探針蹄選到的兩個新基因[77]，列分析表明其與ERs有很強的同源性，所以命名為ERRs，目前該家族有ERRa、ERRP和ERRy三個成員。人ERRa蛋白由423個氨基酸組成，其編碼基因位染色體llql3位點；ERR(3蛋白由500個氨基酸組成，其編碼基因位于染色14q243位點；ERRy蛋白由458個氨基酸組成，其編碼基因位于染色體lq41位點178】。三種ERRs蛋白的DBD和配體結(jié)合區(qū)域（ligand-binding domain, LBD)

圖1.3 ERs和ERRs蛋白的DBD和LBD同源性分析三種ERRs在組織分布上有特異性。ERRa的表達范圍較廣，在胚胎期和成體組織中均能檢測到ERRa的表達，如胎盤尿囊紙膜，發(fā)育中的腎臟、心肌、消化道、骨豁、泌尿生殖器上皮、中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)、和褐色脂肪組織，以及成體中的心、腦、骨豁肌、腎、睪丸肝、肺、陰道等【77，8_]。ERRP的表達水平相對較低，最早也在胚胎期就被檢測到，但也只在最后發(fā)育成域毛膜的細胞中表達，ERRP在成年大鼠的腎臟、心臟、睪丸、腦、前列腺等組織中可檢測到，另外在成年小鼠的腎臟和心臟中有微弱表達，，ERRP在個體發(fā)育中也發(fā)揮重要作用，ERR卩的敲除的大鼠會由于晶胚發(fā)育障礙而死亡[82_84】。ERRy在胚胎期的大腦中高表達，在腎臟和肺中也有表達，在多種成體組織如心、腦、胎盤、骨路肌、腎、胰腺、腎上腺、甲狀腺、氣管、脊髓、視網(wǎng)膜、前列腺、睪丸、小腸中都可見其表達[85’86]。1. 1.3. 2 ERR a的表達調(diào)控
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R33

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本文編號：2696970