【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物(M. tuberculosis complex)感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病,每年導(dǎo)致大約860萬結(jié)核病新發(fā)病例和130萬左右患者死亡�？ń槊�(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)作為一種1920年代發(fā)展的牛分枝桿菌(M. bovis)減毒活疫苗,目前仍然在全世界范圍內(nèi)用于免疫接種兒童。Ag85復(fù)合物是結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、牛分枝桿菌(M. bovis)及BCG等主要的分泌性濾液蛋白,主要包括3個(gè)組分Ag85A、Ag85B和Ag85C,大小分別為31 kDa、30kDa和31.5 kDa,大約以3：2：1的比例分泌于培養(yǎng)液中。Ag85復(fù)合物具有分枝酰轉(zhuǎn)移酶活性,是維持分枝桿菌細(xì)胞壁完整性的重要結(jié)構(gòu)。近年來研究表明,Ag85A蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答,是目前最具潛力的疫苗候選抗原之一。樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)和巨噬細(xì)胞(macrophage, Mφ)作為機(jī)體內(nèi)單核吞噬系統(tǒng)主要成員,都起源于骨髓內(nèi)未分化的造血干細(xì)胞,并且具有相似的免疫功能：DC和MΦ都可以吞噬入侵的病原體,通過胞內(nèi)各種效應(yīng)物質(zhì)對(duì)其進(jìn)行殺傷清除;兩者都可以通過表面及胞內(nèi)受體識(shí)別病原體及其組分,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及一系列天然免疫應(yīng)答；兩者都可以加工處理及提呈外源抗原,激活T細(xì)胞并誘導(dǎo)獲得性免疫應(yīng)答。但是作為機(jī)體免疫防御體系的重要組成部分,DC和MΦ針對(duì)分枝桿菌抗原的抗原提呈功能及機(jī)制還需要進(jìn)入深入的研究。本文首先對(duì)Ag85A蛋白及BCG誘導(dǎo)機(jī)體特異性獲得性免疫應(yīng)答規(guī)律進(jìn)行了研究；隨后分別在體外及體內(nèi)條件下探討了BCG感染早期C57BL/6小鼠DC和MΦ產(chǎn)生針對(duì)Ag85A特異性抗原提呈活性在內(nèi)的一系列免疫應(yīng)答功能規(guī)律；并對(duì)BCG感染早期C57BL/6小鼠DC和MΦ的84種免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了比較分析,為深入揭示DC和MΦ發(fā)揮抗原提呈功能的細(xì)胞及分子機(jī)制提供線索。1.牛分枝桿菌BCG Ag85A蛋白的可溶性原核表達(dá)及免疫應(yīng)答特性研究通過使用冷休克表達(dá)系統(tǒng)和含有伴侶蛋白質(zhì)粒的宿主菌,成功實(shí)現(xiàn)了Ag85A蛋白的可溶性原核表達(dá),通過親和層析純化和Western blot鑒定,結(jié)果顯示其具有較好的免疫反應(yīng)性。Ag85A蛋白免疫C57BL/6小鼠后,血清中檢測(cè)到高水平的IgG抗體效價(jià),表明Ag85A蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫應(yīng)答。通過對(duì)特異性抗原刺激的脾臟和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示培養(yǎng)上清中檢測(cè)到高水平的IFN-γ、TNF-α等Thl型細(xì)胞因子,而IL-4、IL-6等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平較低。另外小鼠脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比值均有所上升,表明Ag85A蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的特異性Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答。2.BCG、增強(qiáng)表達(dá)Ag85A重組BCG誘導(dǎo)的針對(duì)Ag85A特異性免疫應(yīng)答研究BCG免疫C57BL/6小鼠后,血清中檢測(cè)到高水平的Ag85A特異性IgG抗體效價(jià),表明BCG可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈針對(duì)Ag85A的體液免疫應(yīng)答。通過對(duì)特異性抗原刺激的脾臟和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示培養(yǎng)上清中檢測(cè)到高水平的IFN-γ、TNF-α等Thl型細(xì)胞因子,而IL-4、IL-6等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生水平較低。另外小鼠脾臟和腹股溝淋巴結(jié)中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比值均顯著上升,表明BCG可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的針對(duì)Ag85A特異性Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過分枝桿菌穿梭質(zhì)粒pMV261構(gòu)建了增強(qiáng)表達(dá)Ag85A抗原的重組BCG, Western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與BCG相比,重組BCG菌體中Ag85A蛋白含量明顯增加,表明Ag85A蛋白在重組BCG中成功實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)表達(dá)。隨后對(duì)重組BCG免疫C57BL/6小鼠后誘導(dǎo)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答水平測(cè)定結(jié)果顯示,小鼠血清中特異性Ag85A抗體水平以及脾臟和腹股溝淋巴結(jié)細(xì)胞經(jīng)特異性抗原刺激后IFN-y分泌水平均顯著上升,表明其可能具有更好的免疫保護(hù)效果,顯示出其作為結(jié)核病疫苗研發(fā)的前景。3.BCG體外感染小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抗原提呈功能研究使用不同MOI值rBCG-GFP分別進(jìn)行體外感染磁分選C57BL/6小鼠脾臟DCs和MΦs,結(jié)果顯示,MΦs的感染比例顯著高于DCs,表明小鼠脾臟MΦs對(duì)于分枝桿菌的吞噬能力要強(qiáng)于脾臟DCs。BCG感染后,小鼠脾臟DCs和MΦs胞內(nèi)的ROS水平均有所上升,DCs胞內(nèi)的iNOS水平有所上升,而MΦs胞內(nèi)的iNOS含量似乎呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。另外,MΦ胞內(nèi)的ROS、iNOS和NO含量均要高于DCs,表明BCG感染后小鼠脾臟MΦs的殺傷活性要高于小鼠DCs。對(duì)BCG體外感染小鼠脾臟DCs和MΦs分泌的細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果顯示BCG感染后小鼠脾臟DCs產(chǎn)生較高水平的IL-6、IFN-y和TNF-α,小鼠脾臟MΦs分泌較高水平的TNF-α和IL-10,以及一定水平的MCP-1,表明巨噬細(xì)胞在分泌炎性因子誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用,而樹突狀細(xì)胞則側(cè)重于啟動(dòng)機(jī)體T細(xì)胞免疫應(yīng)答。體外抗原提呈試驗(yàn)結(jié)果顯示,使用Ag85A多肽、Ag85A蛋白、BCG對(duì)小鼠脾臟DCs和MΦs進(jìn)行刺激培養(yǎng),小鼠脾臟DCs和MΦs均可以檢測(cè)到特異性抗原提呈信號(hào),且DCs的抗原提呈活性更高,表明小鼠脾臟DCs和MΦs均具有針對(duì)BCG表達(dá)Ag85A蛋白的特異性抗原提呈功能。4.BCG體內(nèi)感染小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞抗原提呈功能研究使用rBCG-GFP感染C57BL/6小鼠,并對(duì)小鼠體內(nèi)DCs和MΦs的感染比例進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示rBCG-GFP尾靜脈注射后,其中脾臟DC的感染比例最高達(dá)到1%-2%左右；而MΦs感染比例在48h達(dá)到3.27%。而rBCG-GFP皮下注射后,腹股溝淋巴結(jié)DCs和MΦs感染比例均隨著時(shí)間的延長而不斷上升,在96h感染比例分別達(dá)到2.11%和5.53%。結(jié)果表明,在感染早期,小鼠MΦs針對(duì)BCG的吞噬感染水平要高于DCs。對(duì)BCG皮下感染C57BL/6小鼠腹股溝淋巴結(jié)DC和MΦ胞內(nèi)的BCG菌CFU值進(jìn)行滴定,結(jié)果顯示小鼠腹股溝淋巴結(jié)DCs和MΦs均感染有一定數(shù)目的BCG,在感染早期隨著時(shí)間的延長胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)逐漸增多；并且MΦ胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)要高于DC,表明分枝桿菌感染早期,MΦ對(duì)于BCG的吞噬能力要強(qiáng)于DC。大約7天后,MΦs胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)有所下降,并且低于DCs,結(jié)果表明DC可能并不能有效清除胞內(nèi)感染的BCG,而MΦ則有著更高的清除殺傷活性。BCG感染后小鼠腹股溝淋巴結(jié)DCs和MΦs表面MHCⅡ分子以及CD40、CD80和CD86等共刺激分子表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示,在BCG皮下感染12h后DCs表面分子均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),隨后逐漸下降；而MΦs表面MHCⅡ和CD40分子表達(dá)水平呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì),但是MΦs表面上述與抗原提呈及T細(xì)胞活化相關(guān)分子的表達(dá)水平仍然低于DCs,表明BCG感染后小鼠體內(nèi)只有DCs得以有效活化。對(duì)于BCG體內(nèi)感染后小鼠DCs和MΦs針對(duì)BCG表達(dá)Ag85A特異性抗原提呈作用規(guī)律的研究結(jié)果顯示,尾靜脈注射Ag85A蛋白后,小鼠脾臟DCs和MΦs均可以檢測(cè)到一定水平的抗原提呈活性信號(hào),并且在4h后信號(hào)達(dá)到高峰。Ag85A蛋白通過皮下注射后,信號(hào)有所延遲,注射24h后檢測(cè)到DCs和MΦs產(chǎn)生抗原提呈信號(hào)。而使用BCG皮下感染C57BL/6小鼠后,小鼠腹股溝淋巴結(jié)DCs在12-24h左右產(chǎn)生高水平的抗原加工提呈活性,在96h小時(shí)后信號(hào)消失,而腹股溝淋巴結(jié)MΦs則沒有檢測(cè)到信號(hào)。上述結(jié)果表明,在BCG體內(nèi)感染早期,DCs可以對(duì)Ag85A抗原進(jìn)行有效抗原提呈,并且抗原提呈信號(hào)短時(shí)間內(nèi)迅速消失,而巨噬細(xì)胞沒有產(chǎn)生特異性抗原提呈活性。5.BCG體內(nèi)感染小鼠樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄譜分析本研究通過RT2 Profiler PCR Array方法對(duì)BCG皮下感染12h和48h的C57BL/6小鼠腹股溝淋巴結(jié)DCs和MΦs的84種免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示,BCG感染早期,小鼠DCs和MΦs大量基因顯著上調(diào),數(shù)目及水平均高于下調(diào)基因,表明小鼠DCs和MΦs啟動(dòng)一系列免疫基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮各種免疫應(yīng)答效應(yīng)；同時(shí)小鼠DCs和MΦs顯著上調(diào)基因數(shù)目及變化水平隨著感染時(shí)間延長而逐漸下降,表明兩種細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌免疫應(yīng)答效應(yīng)處于逐漸降低的趨勢(shì)；小鼠DCs參與抗原提呈及T細(xì)胞活化的基因轉(zhuǎn)錄水平要高于MΦs,而MΦs表面識(shí)別受體、炎性因子基因的轉(zhuǎn)錄水平變化要更高,進(jìn)一步證實(shí)了DCs功能側(cè)重于抗原提呈、誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答,而MΦs主要發(fā)揮病原吞噬殺傷、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。一些潛在功能相關(guān)基因的搜尋為小鼠DCs和MΦs抗原提呈功能機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了線索。
【圖文】：

結(jié)核分枝桿菌在感染宿主體內(nèi)的生存取決于巨枿細(xì)胞，因?yàn)榫薅?xì)胞具有有效的抗菌逡逑能力，結(jié)核分枝巧菌具有各種機(jī)制來因?qū)λ拗鞯姆烙鶛C(jī)制，主要是對(duì)于宿主細(xì)胞溶酶體成逡逑熟的抑制（圖１）邋［１Ｄ］。包含非結(jié)核分枝桿菌病原體的吞懂體，比如大腸桿菌，吞隨體將會(huì)逡逑伴隨著逐漸酸化的過程從早期成熟為晚期吞?hào)w。晚期吞?hào)w的酸性環(huán)境可Ｗ促進(jìn)與溶酶逡逑體的融合，另外在fi期溶酶體中活性氧和活性氮產(chǎn)物的產(chǎn)生對(duì)病原體的殺傷具有至關(guān)重要逡逑的作用。當(dāng)酸性吞隆體中溶酶體酶的ｐＨ值適宜時(shí)，，將會(huì)降解吞y的病原體。但是，結(jié)核逡逑分枝桿菌通過在早期抑制吞嗟體的成熟，從而阻止吞?hào)?xì)胞對(duì)其進(jìn)行殺傷和降解，中和吞逡逑晚體的ｐＨ值對(duì)于抑制吞瞻體的成熟十分關(guān)鍵。靜息巨枿細(xì)胞僅具有微弱的抗菌活性，因逡逑此巨枿細(xì)胞發(fā)揮抗菌活性需要進(jìn)行誘導(dǎo)激活，而一些細(xì)胞因子則可Ｗ有效活化巨枿細(xì)胞。逡逑由Ｔ細(xì)胞產(chǎn)生的ＩＦＮ－Ｙ則是介導(dǎo)巨枿細(xì)胞活化的最有效細(xì)胞因子

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