【摘要】：布魯氏菌病是在世界廣泛流行的傳染性人畜共患病。布魯氏菌是其致病菌,革蘭氏染色為陰性,屬于胞內菌。鞭毛蛋白FliC是布魯氏菌鞭毛絲的主要組成部分,參與細菌對宿主的致病過程,是重要的病原相關分子模式之一(PAMPs)。有研究將缺失fliC基因后的布魯氏菌通過腹腔注射感染小鼠,發(fā)現(xiàn)其毒力增強。但fliC缺失株感染后引發(fā)宿主細胞基因表達的變化機制還有待研究。本研究利用PCR技術及T4 DNA連接酶,通過重疊延伸PCR反應及T4 DNA連接酶連接平末端,成功構建同源重組質粒pGEM-7Zf(+)-ΔfliC。然后利用電轉化手段將該重組質粒轉化到布魯氏菌M5-90株,通過PCR驗證及連續(xù)傳代確定其遺傳穩(wěn)定性,最終成功獲得M5-90-ΔfliC基因缺失株。將布魯氏菌M5-90與布魯氏菌M5-90ΔfliC缺失株分別感染小鼠巨噬細胞RAW264.7,TRIzol法提取總RNA。應用miRNA Microarray-Single芯片檢測miRNAs表達譜變化,通過Agilent芯片檢測基因表達譜變化。芯片實驗結果發(fā)現(xiàn)了 15個差異倍數(shù)≥2的miRNAs及388個差異倍數(shù)≥2的mRNAs。經qRT-PCR驗證后,發(fā)現(xiàn)10個下調的miRNAs表達量變化與芯片結果一致,分別為:mmu-miR-6965-3p、mmu-miR-328-5p、mmu-miR-7683-3p、mmu-miR-7072-5p、mmu-miR-691、mmu-miR-3070-2-3p、mmu-miR-7056-5p、mmu-miR-1907、mmu-miR-486a-3p、mmu-miR-409-3p。利用TargetScan和miRDB數(shù)據(jù)庫對差異miRNA及差異mRNA表達譜進行聯(lián)合分析,發(fā)現(xiàn)39個靶基因,再經qRT-PCR驗證后,確認38個靶基因表達量與芯片結果一致,并且最終預測得到80對miRNA與靶基因的對應關系。之后選取與免疫、細胞凋亡相關基因:白細胞介素17受體Il17ra、卷曲蛋白Fzd7和促凋亡蛋白Bmf基因為研究對象。根據(jù)預測的miRNA-mRNA關系,利用miRNAmimics轉染RAW264.7,通過qRT-PCR驗證確定miRNAs與靶基因的對應關系,結果初步得到miRNA-預測靶基因的對應關系mmu-miR-7056-5p與Bmf、mmu-miR-328-5p與Bmf、mmu-miR-691 與Il17ra、mmu-miR-328-5p 與Fzd7。本研究為發(fā)現(xiàn)fliC在布魯氏菌感染RAW264.7過程中的作用提供理論支持。
【圖文】：

氏菌病疫情報道較多，其中內蒙古最為嚴重，其次是黑龍江、吉林和遼寧。全國逡逑人口布魯氏菌發(fā)病報告顯示，２００４年￣２０１５年，人的布魯氏菌病發(fā)病率持續(xù)增加逡逑（圖１）。通過實際調查與分析，人感染布魯氏菌的原因有很多：不平衡集約化逡逑畜牧生產（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ邋ａｎｉｍａｌ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，，ＩＡＰ）、監(jiān)督管理相關的法律法規(guī)的不健逡逑全、民眾對于該病防范沒有足夠的認識和衛(wèi)生意識（Ｚｈａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１５）。逡逑全球總共有１７０多個國家和地區(qū)報道過人畜布魯氏菌病，保守估計全球１４逡逑億頭牛中至少有３億感染了布魯氏菌（ｄｅＦｉｇｕｅｉｒｅｄｏｅｔａｌ．，邋２０１５）。地中海地區(qū)，美逡逑國的南部和中部，非洲，亞洲，阿拉伯半島、印度次大陸、中東、部分太平洋島逡逑國都有布魯氏菌病的報道（Ｇａｌｉｎｓｋａｅｔａｌ．，２０１３）。在一些地區(qū)，每１０，邋００，邋０００人逡逑布魯氏菌感染率如下：沙特阿拉伯２１４．４人，伊朗２３８．６人，土耳其２６２．２人，逡逑伊拉克２７８．４人

便開始在細胞內長期生存。逡逑２．４布魯氏菌在宿主細胞內的運輸逡逑布魯氏菌通過限制ＢＣＶ與溶酶體融合來逃避宿主細胞的破壞（圖２）邋（ｄｅ逡逑Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１５）。在胞內運輸過程，首先是質膜相關脂質筏（Ｐｌａｓｍａ逡逑ｍｅｍｂｒａｎｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｌｉｐｉｄ邋ｒａｆｔｓ）包裹布魯氏菌形成ＢＣＶ，協(xié)助布魯氏菌侵入巨嗤逡逑細胞。在ＢＣＶ成熟過程，先被早期內涵體抗原－ｌ（ｅａｒｌｙ邋ｅｎｄｏｓｏｍｅ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋１，ＥＥＡ１邋）、逡逑Ｒａｂ５標記，后被ＲＡＢ７標記。同時，ＢＣＶ的生物合成和運輸受由布魯氏菌Ｔ４ＳＳ逡逑分泌的效應蛋白的調節(jié)。在運輸過程中，含有病原微生物的ＢＣＶ雖然為溶酶體逡逑相關膜蛋白邋１邋（ｌｙｓｏｓｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１，ＬＡＭＰ１）陽性，但不與逡逑含組織蛋白酶Ｄ邋（ｃａｔｈｅｐｓｉｎＤ）的溶酶體融合，進而保護了布魯氏菌不受溶酶體逡逑降解。隨著ＥＲ的結構和功能的改變
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

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本文編號：2695914