【摘要】：情緒和認(rèn)知是高級(jí)神經(jīng)精神活動(dòng)的重要內(nèi)容,其功能研究是腦科學(xué)研究的重要部分。免疫系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的思維活動(dòng),其機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜,其中亦包括免疫細(xì)胞以及免疫分子如細(xì)胞因子等對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)作用。并且,神經(jīng)精神疾病與免疫系統(tǒng)炎癥密切相關(guān),可表現(xiàn)為臨床上常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病與免疫系統(tǒng)的“共病”現(xiàn)象,包括慢性炎癥與抑郁癥“共病”,艾滋病與癡呆癥“共病”的現(xiàn)象等。其中免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子以及趨化因子是導(dǎo)致該“共病”現(xiàn)象的重要活性分子,發(fā)揮對(duì)認(rèn)知功能相關(guān)疾病如阿爾茨海默病,以及情緒障礙相關(guān)疾病如焦慮癥、抑郁癥等疾病的重要調(diào)節(jié)作用。聯(lián)體結(jié)合模型(Parabiosis)通過血管吻合術(shù)將兩只小鼠腹部縫合在一起,使兩只小鼠共用一套血液循環(huán)系統(tǒng)。近年來,該模型被廣泛應(yīng)用于衰老領(lǐng)域的研究,是研究免疫分子對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能影響的重要模型。2011年斯坦福大學(xué)Tony Wyss-Coray教授課題組為研究免疫微環(huán)境對(duì)機(jī)體衰老的影響,采用聯(lián)體結(jié)合模型,篩選出6個(gè)系統(tǒng)因子(Systemic factor)在這一過程中發(fā)揮重要作用,包括CCL2(MCP-1)、CCL11(Eotaxin)、CCL12(MCP-5)、CCL19(MIP-3β)、β_2M(β_2 microglobulin)、觸珠蛋白(Haptoglobin)。這六個(gè)系統(tǒng)因子中,CCL2及CCL12對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能的調(diào)節(jié)作用已有較多報(bào)道,CCL2水平升高與認(rèn)知功能損傷程度呈正相關(guān),CCL12與低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥關(guān)系密切。該團(tuán)隊(duì)隨后研究表明,CCL11、β_2M可抑制小鼠海馬區(qū)的神經(jīng)發(fā)生,導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降;側(cè)腦室注射CCL11中和抗體可顯著改善CCL11對(duì)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生的抑制作用,恢復(fù)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力,而敲除β_2M基因亦可改善上述損傷。趨化因子CCL19是在聯(lián)體結(jié)合模型基礎(chǔ)上篩選出的6個(gè)系統(tǒng)因子之一。它屬于趨化因子CC家族,其受體為CCR7。在免疫系統(tǒng)中,CCL19主要由中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌,其受體主要表達(dá)在T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞表面。CCL19通過與CCR7受體結(jié)合趨化T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞遷移至病灶區(qū)域發(fā)揮作用。此外,CCL19/CCR7軸亦對(duì)T淋巴細(xì)胞的歸巢及存活發(fā)揮重要作用。近年來研究表明,大腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞以及腦血管內(nèi)皮細(xì)胞皆可分泌趨化因子CCL19,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥時(shí),趨化免疫細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),到達(dá)病灶區(qū)域。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)亦伴隨著血漿中CCL19表達(dá)水平的異常,例如多發(fā)性硬化癥、腦缺血性損傷、神經(jīng)炎癥疾病的患者,其血液和腦脊液中趨化因子CCL19的表達(dá)水平皆異常升高。CCL19受體CCR7可表達(dá)于海馬、胼胝體區(qū)域的星形膠質(zhì)細(xì)胞,然而其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響尚不清楚。CCR7基因敲除的小鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的損傷,以及抑郁及焦慮樣情緒障礙。以上研究提示趨化因子CCL19/CCR7對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用不可忽視。情緒和認(rèn)知是最為重要的兩類腦高級(jí)神經(jīng)精神功能,但是,目前報(bào)道趨化因子CCL19對(duì)情緒以及認(rèn)知功能的影響尚不明確。本課題以正常小鼠以及長期不可預(yù)期性慢性應(yīng)激模型小鼠為研究對(duì)象,研究趨化因子CCL19對(duì)小鼠認(rèn)知樣行為以及情緒樣行為的影響。并從免疫系統(tǒng)功能和神經(jīng)系統(tǒng)功能兩個(gè)方面,研究趨化因子CCL19對(duì)認(rèn)知或情緒樣行為影響的機(jī)制。第一部分趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠認(rèn)知及情緒樣行為的影響1.趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠認(rèn)知樣行為的影響選取2-3月齡C57BL/6小鼠,分別側(cè)腦室單次注射CCL19(0.05μg)以及隔天腹腔注射CCL19(10μg/kg),注射共12次歷時(shí)35天。通過六臂水迷宮實(shí)驗(yàn),觀察CCL19對(duì)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響;通過新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn),觀察CCL19對(duì)小鼠物體識(shí)別記憶能力的影響。結(jié)果表明,趨化因子CCL19單次側(cè)腦室注射和腹腔注射12次,均對(duì)小鼠在六臂水迷宮實(shí)驗(yàn)中的錯(cuò)誤數(shù),新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中物體辨識(shí)指數(shù)無顯著影響,提示趨化因子CCL19對(duì)小鼠的認(rèn)知樣行為無顯著影響。2.趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠情緒樣行為的影響采用上述給藥方式,通過高架O型迷宮實(shí)驗(yàn)和糖水消耗實(shí)驗(yàn),觀察趨化因子CCL19對(duì)小鼠焦慮及抑郁樣情緒的影響。結(jié)果表明,趨化因子CCL19顯著增加了小鼠的糖水消耗率,減少了小鼠在高架O型迷宮中開放臂的停留時(shí)間。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,趨化因子CCL19可能對(duì)小鼠的焦慮及抑郁樣行為有明顯影響。3.趨化因子CCL19、CCL21中和抗體對(duì)小鼠焦慮及抑郁樣行為的影響趨化因子CCL21是趨化因子CCL19的共受體因子,可以與CCR7結(jié)合發(fā)揮對(duì)免疫細(xì)胞的趨化作用。CCL21對(duì)焦慮及抑郁樣行為的作用亦不明確。因此,本部分實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步確認(rèn)CCL19及CCL21對(duì)焦慮及抑郁樣行為的影響,并采用CCL19及CCL21中和抗體研究CCL19及CCL21對(duì)情緒反應(yīng)的作用。選用2-3月齡C57BL/6小鼠,分為五組,分別為正常組(腹腔注射PBS),CCL19組,CCL21組,CCL19中和抗體組,CCL21中和抗體組。隔天腹腔注射CCL19、CCL21(均為10μg/kg),注射共12次歷時(shí)35天。第30天時(shí),分別側(cè)腦室注射CCL19、CCL21(均為0.05μg)中和抗體及同型對(duì)照抗體(正常組及CCL19、CCL21處理組注射同型對(duì)照抗體0.05μg)。第36天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。通過高架十字迷宮以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的焦慮樣行為,通過糖水消耗實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的抑郁樣行為。結(jié)果表明,各處理組小鼠的自主活動(dòng)性均無顯著性差異。CCL19腹腔注射顯著增加小鼠的糖水消耗率,降低小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間,對(duì)小鼠在高架十字迷宮中的開放臂停留時(shí)間以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中間區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間無顯著影響。提示CCL19對(duì)小鼠抑郁樣行為有顯著影響,對(duì)小鼠焦慮樣行為無明顯影響。CCL21腹腔注射顯著增加小鼠糖水消耗率,對(duì)小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的中間區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間及高架十字迷宮的開放臂停留時(shí)間無顯著影響。提示CCL21對(duì)小鼠焦慮及抑郁樣行為均無明顯影響。側(cè)腦室注射趨化因子CCL19以及CCL21中和抗體后觀察小鼠的抑郁和焦慮樣行為,結(jié)果表明小鼠在上述各行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)與同型對(duì)照抗體注射組小鼠表現(xiàn)無顯著差異,提示側(cè)腦室注射CCL19、CCL21中和抗體對(duì)CCL19及CCL21的情緒相關(guān)作用無顯著影響。第二部分趨化因子CCL19對(duì)長期不可預(yù)期性慢性應(yīng)激小鼠抑郁及焦慮樣行為的影響在確定CCL19對(duì)正常小鼠的抑郁樣行為有顯著影響的基礎(chǔ)上,采用長期不可預(yù)期性慢性應(yīng)激(CUMS)模型,評(píng)價(jià)趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠焦慮樣及抑郁樣行為的影響。實(shí)驗(yàn)分五組,分別為正常組(腹腔注射PBS),CUMS模型組(腹腔注射PBS),陽性藥氟西汀給藥組(10 mg/kg),CCL19組(10μg/kg),CCL19與氟西汀合用組(10μg/kg+10 mg/kg)。隔天腹腔注射CCL19,注射共12次歷時(shí)35天。第25天至第35天,每天腹腔注射氟西汀,給藥共10次。造模持續(xù)35天,于第36天進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。1.趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠體重及自主活動(dòng)的影響采用自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠的自主活動(dòng)性的影響。結(jié)果表明,CUMS造模顯著降低小鼠體重,氟西汀及趨化因子CCL19腹腔注射可以在造模后期(第22天至第24天)緩解小鼠體重的下降。各處理組小鼠的自主活動(dòng)性均無顯著性差異。2.趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠焦慮樣行為的影響通過高架十字迷宮以及曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的焦慮樣行為。結(jié)果表明,CUMS模型鼠在高架十字迷宮開放臂停留時(shí)間顯著減少,在曠場(chǎng)的中間區(qū)域時(shí)間顯著減少,提示CUMS模型小鼠出現(xiàn)明顯的焦慮樣行為。氟西汀、CCL19以及兩者合用對(duì)小鼠在高架十字迷宮開放臂停留時(shí)間及曠場(chǎng)中間區(qū)域時(shí)間均無顯著影響,提示氟西汀及CCL19對(duì)小鼠的焦慮樣行為無顯著影響。3.趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠抑郁樣行為的影響通過糖水消耗實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的抑郁樣行為。結(jié)果表明,CUMS模型小鼠的糖水消耗率顯著降低,強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加,提示CUMS模型小鼠表現(xiàn)為抑郁樣行為。氟西汀和CCL19顯著增加CUMS模型小鼠糖水消耗率,降低其強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間,提示氟西汀及CCL19對(duì)小鼠的抑郁樣行為有顯著改善作用。CCL19與氟西汀合用對(duì)小鼠的糖水消耗率、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間無進(jìn)一步影響。第三部分趨化因子CCL19對(duì)小鼠抑郁樣情緒影響的機(jī)制研究趨化因子CCL19能改善CUMS模型小鼠的抑郁樣行為,在此基礎(chǔ)上,從免疫系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)兩方面評(píng)價(jià)趨化因子CCL19對(duì)小鼠抑郁樣情緒影響的機(jī)制。1.趨化因子CCL19對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)功能的影響1.1趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠免疫功能的影響趨化因子CCL19在免疫系統(tǒng)的主要功能是趨化免疫細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞的遷移,參與維持T淋巴細(xì)胞的壽命,對(duì)機(jī)體的免疫功能有重要作用。本研究首先通過[~3H]-TdR摻入法觀察趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明,趨化因子CCL19能夠顯著抑制ConA和LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)。接下來,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CCL19對(duì)正常小鼠全血免疫細(xì)胞比例的影響。結(jié)果表明,趨化因子CCL19能夠增加調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞百分比,降低CD4~+、CD8+T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞百分比。進(jìn)而,采用Luminex實(shí)驗(yàn)研究趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠海馬和血漿中細(xì)胞因子表達(dá)的影響。共檢測(cè)13個(gè)跟炎性反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞因子,包括CCL19,CCL21,IL-β,TNF-α,IL-4,IL-10,IL-6,IL-17,IFN-γ,RANTES,CCL2,CX3CL1,CCL17等。結(jié)果表明,CCL19腹腔注射顯著降低海馬腦區(qū)RANTES、IL-1、IL-1β等表達(dá)水平,CCL19中和抗體能夠逆轉(zhuǎn)CCL19對(duì)這些細(xì)胞因子的降低作用。CCL19對(duì)正常小鼠血漿中各細(xì)胞因子表達(dá)無明顯影響。CCL19腹腔注射對(duì)正常小鼠血漿中CCL19的水平有降低趨勢(shì),對(duì)小鼠海馬中CCL19的水平有升高趨勢(shì)。CCL19中和抗體能夠逆轉(zhuǎn)CCL19腹腔注射對(duì)小鼠血漿及海馬CCL19水平的作用。1.2趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠免疫功能的影響采用Luminex實(shí)驗(yàn)研究趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠海馬和血漿中細(xì)胞因子表達(dá)的影響。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,CUMS模型小鼠海馬中CX3CL1、IL-10及IL-1β表達(dá)水平顯著降低。氟西汀顯著升高海馬中CX3CL1、IL-10、IL-1β的水平,CCL19亦顯著升高海馬中CX3CL1的水平,但對(duì)IL-10及IL-1β表達(dá)無明顯影響。CUMS模型小鼠血漿中CCL19水平與對(duì)照組相比有降低趨勢(shì),CCL19腹腔注射對(duì)血漿中CCL19水平無顯著影響。CUMS模型小鼠海馬中CCL19水平與對(duì)照組相比有降低趨勢(shì),CCL19腹腔注射顯著升高CUMS模型小鼠海馬中CCL19的水平。2.趨化因子CCL19對(duì)小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響2.1趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響采用高效液相色譜法檢測(cè)趨化因子CCL19對(duì)正常小鼠大腦氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)以及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。結(jié)果表明,趨化因子CCL19對(duì)小鼠海馬腦區(qū)的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和天冬氨酸的水平有降低作用,對(duì)抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)甘氨酸和γ-氨基丁酸的水平無明顯影響。CCL19對(duì)小鼠下丘腦區(qū)域的多巴胺以及去甲腎上腺素的水平皆有抑制作用,對(duì)5-羥色胺和腎上腺素水平無明顯影響,提示CCL19對(duì)海馬區(qū)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)水平和下丘腦區(qū)多巴胺及去甲腎上腺素水平的抑制作用可能是其影響抑郁樣行為的機(jī)制之一。2.2趨化因子CCL19對(duì)CUMS模型小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響采用上述方法檢測(cè)CCL19對(duì)CUMS模型小鼠大腦神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。結(jié)果表明,CUMS模型小鼠海馬中谷氨酸水平顯著高于對(duì)照組,CCL19顯著降低CUMS模型小鼠海馬谷氨酸水平,氟西汀及其與CCL19合用組亦有降低CUMS模型小鼠海馬谷氨酸水平的趨勢(shì)。CUMS模型小鼠海馬天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸水平與對(duì)照組相比無顯著差異,各給藥組對(duì)CUMS模型小鼠海馬中上述遞質(zhì)水平均無顯著影響。結(jié)果提示,趨化因子CCL19對(duì)海馬區(qū)谷氨酸水平降低作用可能是其影響抑郁樣行為的機(jī)制之一。綜上所述,本研究可得結(jié)論如下:1.CCL19對(duì)正常小鼠的抑郁樣行為有顯著影響,對(duì)小鼠的焦慮樣行為及認(rèn)知樣行為無顯著影響。2.CCL19對(duì)CUMS模型小鼠的抑郁樣行為有顯著改善作用。3.CCL19對(duì)正常小鼠及CUMS模型小鼠的海馬區(qū)細(xì)胞因子表達(dá)有一定影響,主要升高CX3CL1等表達(dá),這可能是其改善小鼠抑郁樣行為的機(jī)制之一。4.CCL19顯著降低正常小鼠及CUMS模型小鼠海馬區(qū)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸水平,這可能是其改善小鼠抑郁樣行為的機(jī)制之一。
【圖文】：

第28頁3.4 六臂水迷宮實(shí)驗(yàn)六臂水迷宮實(shí)驗(yàn)儀器根據(jù)Nature protocol發(fā)表的文章設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（如圖1）[19]。實(shí)驗(yàn)用的水池直徑為 1 m，水池壁高出水面 30 cm，逃生平臺(tái)（圓形，直徑 10 cm，表面粗糙以利于動(dòng)物抓�。┠洳赜谒嫦� 0.5-1 cm，水溫為20℃±1℃。選用 2mm 厚度的鋼板，折成 60°“V”形，“V”形邊長為 30 cm。選擇平滑的“V”形鋼板 6 塊，擺放在水迷宮的水池邊緣，使其形成 6 個(gè)臂

第47頁圖 8 趨化因子 CCL19 及 CCL21，以及二者中和抗體對(duì)小鼠血漿細(xì)胞因子的影響Figure 8 The effect of chemokine CCL19, CCL21 and the antibody on the cytokines in plasma. n=8.*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, versus control; ##P<0.01, ###P<0.001, versus CCL19; &P<0.05,&&P<0.01, &&&P<0.001, versus CCL21 by Dunnett’s post hoc test and one-way ANOVA.
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R338

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 任麗娜;張家瑞;劉梅;;氟西汀致大鼠腹瀉作用研究[J];精神醫(yī)學(xué)雜志;2014年04期

2 李煥德;鄧孟先;;氟西汀的副作用[J];國外醫(yī)學(xué).精神病學(xué)分冊(cè);1993年04期

，

本文編號(hào)：2693410