發(fā)布時(shí)間：2020-06-02 14:29

【摘要】：研究背景:癲癇(epilepsy)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,頻發(fā)的癲癇發(fā)作可導(dǎo)致腦部嚴(yán)重的損害、意外傷害及精神創(chuàng)傷等,給患者、家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。目前我國(guó)的癲癇的患病率約7.2‰,存在900余萬(wàn)的癲癇患者,雖經(jīng)正規(guī)的抗癲癇藥物治療,仍有近1/3患者的癲癇發(fā)作難以得到有效的控制,發(fā)展為難治性癲癇,其中顳葉癲癇(Temporal lobe epilepsy,TLE)是最常見(jiàn)的難治性癲癇。氯化鋰-匹魯卡品大鼠癲癇模型是Honchar于1983年首次報(bào)道,該模型與人類(lèi)顳葉癲癇模型在神經(jīng)電生理、神經(jīng)元損傷、行為學(xué)表現(xiàn)等方面相似,是目前研究顳葉癲癇和癲癇持續(xù)狀態(tài)常用的動(dòng)物模型之一。A型肉毒毒素(Botulinum neurotoxin A,BoNT/A)是一種由厭氧梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素蛋白,可特異性酶切突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白,進(jìn)而抑制突觸前膜神經(jīng)遞質(zhì)釋放,抑制Na~+通道,降低神經(jīng)元興奮性,為抗癲癇作用提供了理論依據(jù)。近來(lái)研究表明顱內(nèi)海馬區(qū)注射肉毒毒素(Botulinum neurotoxin,BoNT)可抑制急性期癲癇發(fā)作,減輕海馬神經(jīng)元損傷,減少慢性期癲癇發(fā)作頻率,進(jìn)一步證實(shí)了BoNT可作為一種潛在的抗癲癇藥物。然而,既往的研究均采用顱內(nèi)注射給藥方式,存在創(chuàng)傷性、操作復(fù)雜、易感染、不利于長(zhǎng)期給藥等弊端,且未進(jìn)一步探討B(tài)oNT的作用機(jī)制。相較于顱內(nèi)注射,鼻腔給藥是一種方便、無(wú)創(chuàng)性的給藥方式,并可繞過(guò)血腦屏障,快速進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),滿(mǎn)足了慢性疾病需長(zhǎng)期給藥的需求。目前對(duì)BoNT/A抑制癲癇發(fā)作的具體機(jī)制、能否通過(guò)鼻腔給藥減少癲癇持續(xù)狀態(tài)誘發(fā)的神經(jīng)元損傷,還有待進(jìn)一步研究。研究目的:本課題通過(guò)觀察氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠神經(jīng)元形態(tài)學(xué)及自噬、凋亡相關(guān)蛋白Beclin-1、Bax,Caspase-3及Bcl-2表達(dá)水平的改變,探討癲癇誘發(fā)神經(jīng)元損傷的機(jī)制;探究鼻腔滴注BoNT/A給藥方式的可行性,觀察其對(duì)致癇大鼠行為學(xué)、神經(jīng)元損傷的影響,并檢測(cè)凋亡自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平,探討B(tài)oNT/A神經(jīng)保護(hù)作用的潛在機(jī)制。材料與方法:120只健康雄性SD大鼠,6-7周,220g-250g,隨機(jī)分為CON組(正常大鼠)、PILO組(致癇大鼠)、PILO+NS組(致癇大鼠+鼻腔滴注生理鹽水)和PILO+BoNT/A組(致癇大鼠+鼻腔滴注BoNT/A),PILO組包括3h、8h、24h、72h亞組。PILO+NS、PILO+BoNT/A組大鼠腹腔麻醉后取仰臥位,給予鼻腔滴注等量生理鹽水或BoNT/A預(yù)處理,CON、PILO組同期僅給予腹腔麻醉處理,并記錄各組大鼠體重變化。給藥后第50天,四組大鼠給予腹腔注射氯化鋰(3mEq/kg),20小時(shí)后,CON組腹腔注射生理鹽水,余腹腔注射匹魯卡品(30mg/kg)。大鼠癲癇發(fā)作持續(xù)60min后,腹腔注射水合氯醛(0.3mg/kg)終止發(fā)作。根據(jù)Racine癇性發(fā)作等級(jí)標(biāo)準(zhǔn),Ⅳ或V級(jí)發(fā)作判定為造模成功,記錄各組造模成功率及潛伏期。造模成功后PILO組3h、8h、24h亞組于癲癇發(fā)作終止后各時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦,分離海馬,采用Western blot法檢測(cè)相應(yīng)蛋白濃度,72h亞組于發(fā)作終止72小時(shí)后麻醉、灌注取腦,制作石蠟切片,采用尼氏染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元損傷。PILO+NS組、PILO+BoNT/A組于癲癇終止后24小時(shí)取海馬,采用Western blot法檢測(cè)相應(yīng)蛋白濃度,剩余大鼠在SE后72小時(shí)麻醉后灌注取腦,制備石蠟及冰凍切片,觀察神經(jīng)元損傷、檢測(cè)cleaved-SNAP-25。結(jié)果:1.行為學(xué)觀察CON組大鼠行為正常,PILO組、PILO+NS組、PILO+BoNT組大鼠均出現(xiàn)癲癇發(fā)作,3組大鼠造模成功率及潛伏時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。2.神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變與CON組相比,PILO、PILO+NS組神經(jīng)元出現(xiàn)明顯損傷,數(shù)目減小,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),而PILO+BoNT/A組神經(jīng)元數(shù)目較CON組減少,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);與PILO、PILO+NS組相比,PILO+BoNT/A組神經(jīng)元數(shù)目增加,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。3.Cleaved-SNAP-25分子檢測(cè)PILO組大鼠嗅球、海馬神經(jīng)元內(nèi)未檢測(cè)到cleaved-SNAP-25,而PILO+BoNT/A組嗅球、海馬神經(jīng)元胞體內(nèi)可檢測(cè)cleaved-SNAP-25。4.凋亡自噬相關(guān)蛋白表達(dá)與CON組相比,PILO組海馬組織中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低,誘導(dǎo)凋亡蛋白Bax、Beclin-1及Caspase-3蛋白水平升高,24小時(shí)內(nèi)具有明顯的變化趨勢(shì),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);相較于PILO組,PILO+BoNT/A組可抑制癲癇發(fā)作對(duì)相關(guān)蛋白的影響,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),PILO+NS組相關(guān)蛋白的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論:1.氯化鋰-匹魯卡品癲癇模型造模操作簡(jiǎn)便,成功率高,大鼠癲癇行為學(xué)表現(xiàn)明顯。2.癲癇持續(xù)狀態(tài)引起海馬神經(jīng)元損傷,以CA1、CA3區(qū)為著,涉及神經(jīng)元自噬、凋亡途徑。3.BoNT/A可經(jīng)鼻給藥進(jìn)入大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(嗅球、海馬區(qū)),證實(shí)了該給藥途徑的可行性。4.BoNT/A對(duì)氯化鋰-匹魯卡品誘發(fā)的癲癇持續(xù)狀態(tài)導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用,可能參與神經(jīng)元自噬、凋亡途徑。5.鼻腔給藥可為BoNT/A在抗癲癇領(lǐng)域提供新的給藥途徑。
【圖文】：

18圖 1.1：兩組大鼠海馬神經(jīng)元尼氏染色A：CON 組海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元（×200）；B：PILO 組海馬 CA3 區(qū)神經(jīng)元（×200）C：CON 組海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元（×200）；D：PILO 組海馬 CA1 區(qū)神經(jīng)元（×200）

圖 1.2 各組 Bcl-2、Caspase-3、Beclin-2 及 Bax 蛋白的 Western blot 結(jié)果3h: PILO 組 3h；8h：PILO 組 8h；24h：PILO 組 24h圖 1.3 各組 Bax 和 Caspase-3 蛋白含量
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R742.1;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2693297