【摘要】：馬爾尼菲藍狀菌(Talaromyces marneffei,TM),過去稱作馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM),是溫度依賴性雙相病原真菌的一種,也是一種條件致病菌。免疫缺陷和免疫低下的人群是高危人群。主要區(qū)域流行于東南亞和我國南方地區(qū)。它能引起嚴重的散播性馬爾尼菲青霉病(Penicilliosis marneffei,PSM),預后較差,會嚴重危害人體健康,但其雙相轉換和致病機制尚未研究清楚。色氨酸的犬尿氨酸代謝途徑在病原菌感染宿主和宿主清除病原菌過程中都發(fā)揮了重要的作用。該途徑關鍵酶是吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)。當宿主細胞高表達IDO時,能抑制體內真菌的繁殖和傳播,減輕炎癥反應。相反,病原真菌高表達IDO時,能躲避宿主免疫系統(tǒng)攻擊,加重炎癥。多種腫瘤細胞高表達IDO亦能躲避宿主免疫系統(tǒng)的清除。因此猜測馬爾尼菲藍狀菌色氨酸的犬尿氨酸代謝途徑與其致病機制可能有著密切的關系。近年來,越來越多的研究者關注馬爾尼菲藍狀菌的雙相轉換機制,普遍認為其與致病性密切相關。本課題組對馬爾尼菲藍狀菌標準株雙相轉換過程中四個不同生長時相分別進行鏈特異性轉錄組測序。比對分析發(fā)現色氨酸沿犬尿氨酸代謝途徑的相關基因,Tcr1、IDO1和IDO2在菌絲相轉為酵母相或在酵母相時高表達。上述基因在雙相轉換過程中表達差異明顯,故推測它們可能在馬爾尼菲藍狀菌雙相轉換中發(fā)揮重要作用。因此本課題主要對這三個基因的功能進行初步研究,進而探究色氨酸代謝途徑在馬爾尼菲藍狀菌致病過程中的作用特征,為研究馬爾尼菲藍狀菌雙相轉換機制及其致病機制奠定基礎。目的:通過對致病性酵母相高表達的色氨酸代謝途徑中相關的Tcr1、IDO1和IDO2基因功能的初步研究,以便闡明馬爾尼菲藍狀菌中色氨酸代謝途徑的特征,與雙相轉換的關系及其致病的可能機制。方法:利用同源重組的方法,構建目的基因缺失突變株,與出發(fā)菌株Spm4對比,主要觀察基因缺失突變株表型的變化,包括對色氨酸分解代謝能力的變化,對藥物、氧化壓力、滲透壓力和細胞壁壓力敏感性的變化,檢測并比較菌絲相、酵母相特異高表達基因表達量的變化,初步了解目的基因的功能。結果:(1)成功構建Tcr1、IDO1和IDO2基因缺失突變株;(2)在25℃條件下,Tcr1、IDO1基因缺失突變株無法在以色氨酸為唯一碳源和唯一氮源培養(yǎng)板上生長,而IDO2可在上述培養(yǎng)板上生長;(3)相對Spm4,Tcr1缺失突變株對滲透壓力、兩性霉素B和米卡芬凈敏感性稍增加,另外對細胞壁脅迫壓力尤為敏感;(4)相對Spm4,IDO1對兩性霉素B的敏感性明顯下降;(5)IDO2基因缺失突變株對兩性霉素B和米卡芬凈的敏感性下降。(6)IDO1和Tcr1缺失后,酵母相特異性高表達的基因(如MP1,aspergillopepsin F precursor和antigenic cell wall galactomannoprotein等)表達量相對出發(fā)菌株Spm4明顯下降。結論:(1)在25℃條件下,IDO1基因在馬爾尼菲藍狀菌色氨酸分解代謝過程中起主要作用,該基因還可能與細胞膜上兩性霉素B固醇類結合位點的結構相關。(2)在25℃條件下,Tcr1轉錄因子基因參與調控色氨酸的分解代謝。該轉錄因子還可能影響細胞壁的組成及完整性。(3)IDO2基因不是馬爾尼菲藍狀菌色氨酸分解代謝中關鍵基因,但可能與兩性霉素B細胞膜上固醇類結合位點和米卡芬凈細胞壁上葡聚糖結合位點的結構相關。(4)Tcr1和IDO1基因可能參與了酵母形態(tài)形成和維持。
【圖文】：

則會抑制病原真菌的生長和 Th17 淋巴細胞的分化、限制組織的過度炎癥反應[11, 12]。在宿主和真菌都需要代謝和利用色氨酸，共享著相同的中間代謝產物，互相作用，共同影響，，它們之間是如何串擾，尚未清楚�？偠灾�，IDO 在真菌感染后的機體免疫反應中起著重要的調節(jié)作用，影響著感染程度。其在馬爾尼菲藍狀菌感染過程中也可能發(fā)揮著重要的作用。本課題組在前期馬爾尼菲藍狀菌 FRR2161 菌株轉錄組測序結果中，發(fā)現在 37℃致病性酵母相時色氨酸的犬尿酸代謝途徑中 IDO、犬尿酸酶（kynureninase）、乙酰輔酶 A 乙�；D移酶（acetyl-CoA C-acetyltransferase）和 氨 基 羧 酸 縮 醛 半 醛 脫 羧 酶 （ aminocarboxymuconate-semialdehydedecarboxylase，ACMSD）的表達大幅度上調，而犬尿氨酸氧化戊二酸氨基轉移酶（kynurenine-oxoglutarate transaminase）表達下調，最終生成的犬尿酸減少，而犬尿氨酸、吡啶甲酸和乙酰輔酶 A 增加（圖 1-1）。

在酵母相時高表達或者是菌絲相轉向酵母相時表達量增加（圖1-2）。我們猜測色氨酸代謝的犬尿氨酸代謝途徑與酵母細胞形態(tài)的形成和維持都發(fā)揮著重要的作用。在馬爾尼菲藍狀菌基因數據庫中編碼發(fā)現 IDO1 基因和犬尿酸酶基因在同一個基因簇（Gene cluster）上，并在同簇基因上發(fā)現它們的編碼前面有一個 Tcr1 轉錄因子基因，而該轉錄因子基因表達變化趨勢同樣在酵母相和菌絲相轉為酵母相時表達上升（圖 1-2），我們猜測該轉錄因子可能參與調控色氨酸的分解。而 IDO3 基因的表達量在不同溫度條件下都比較穩(wěn)定。圖 1-2 四種生長時相中 Tcr1、IDO1 和 IDO2 基因 RPKM 變化的統(tǒng)計圖。Figure 1-2 The RPKM value change of Tcr1、IDO1 and IDO2 gene during four phase.
【學位授予單位】：廣西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R379

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本文編號：2693970