【摘要】：背景:1885年,在德國Sachsen地區(qū)Borna鎮(zhèn)流行一種造成大量軍馬死亡的疾病,命名為Borna病(Borna disease,BD)。經(jīng)證明Borna病是由一種嗜神經(jīng)病毒感染造成,這種病毒稱為Borna病病毒(Borna disease virus,BDV)。BDV可以感染各種脊椎動物,也包括所有溫血動物。BDV持續(xù)感染許多動物物種的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并導致行為障礙,如焦慮、攻擊、多動、異常行為和認知缺陷。近20年在對精神患者(尤其是精神分裂癥、抑郁癥和雙相情感障礙)的大量流行病學研究中發(fā)現(xiàn),部分精神患者的腦脊液和血液中能檢測到BDV的抗體和核酸,預測與人類精神疾病有關。BDV自然可導致嚴重的免疫介導的神經(jīng)疾病如爆發(fā)性腦炎。但是,在實驗室新生大鼠感染腦炎癥狀不明顯,在不引起神經(jīng)細胞破壞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥的情況卻導致宿主(大鼠)行為學異常和學習認知功能障礙。BDV如何感染以及如何致病仍然不清楚,特別是BDV在宿主的作用起始靶點。目前文獻對BDV的磷蛋白質(zhì)(P)、核蛋白質(zhì)(N)、糖蛋白質(zhì)(G)、非糖基化蛋白質(zhì)(X)作用機制都有研究,其中P蛋白質(zhì)和N蛋白質(zhì)在發(fā)病機制中起主要作用,也是目前研究最多的,特別對P蛋白質(zhì)的研究尤為關注。目的:本實驗針對于BDV的P(P24)質(zhì)粒和N(P40)質(zhì)粒構(gòu)建慢病毒載體,并利用慢病毒載體感染原代神經(jīng)元,篩選出與BDV-P/N蛋白質(zhì)結(jié)合的差異蛋白質(zhì),以期進一步找出與BDV-P/N蛋白質(zhì)結(jié)合的關鍵宿主蛋白質(zhì),并探索其致病作用。方法:1.擴增pEGFP-N1-P24和p EGFP-N1-P40質(zhì)粒(實驗室保存)并測序,用于后續(xù)慢病毒包裝。2.進行慢病毒包裝及滴度測定,并感染原代海馬神經(jīng)元,Western-blot方法檢測P24和P40是否表達。3.提取慢病毒感染胎鼠海馬的蛋白質(zhì)做免疫共沉淀實驗,實驗分為BDV-P(P24)組,BDV-N(P40)組,NC組;抗體分別用P24抗體,P40抗體,兔IgG抗體;免疫共沉淀復合物做LC-MS/MS質(zhì)譜分析。4.質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)復合物成分的結(jié)果,與對照組比對得出差異蛋白質(zhì),進行生物信息學分析對差異蛋白質(zhì)進行預測。5.對上述預測差異蛋白質(zhì)進行驗證。結(jié)果:1.質(zhì)粒擴增后測序序列正確并成功轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞,Western-Bolt驗證P24和P40蛋白質(zhì)正常表達。2.過表達慢病毒載體構(gòu)建成功,并測定滴度為1×109 TU/ml,能成功感染原代細胞并表達BDV-P(P24)和BDV-N(P40)。3.免疫共沉淀復合物質(zhì)譜分析結(jié)果后得到差異蛋白質(zhì),用venny分析篩選到453個與BDV-P相互作用的候選蛋白質(zhì),;篩選到259個與BDV-N相互作用的候選蛋白質(zhì)。4.進行GO,KEGG和PPI網(wǎng)絡注釋以探索這些蛋白質(zhì)之間的作用。根據(jù)生物信息學的分析,預測酰基輔酶A結(jié)合蛋白質(zhì)(ACBP,又名安定受體抑制肽DBI)與BDV-P結(jié)合,RT-qPCR實驗將ACBP(DBI)及涉及的GABA-α1、GABA-α2、GABA-α3進一步驗證,ACBP(DBI)、GABA-α1、GABA-α2上調(diào)(P0.05),GABA-α3沒有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論:1.本實驗成功構(gòu)建BDV-P(P24)和BDV-N(P40)的過表達慢病毒載體,并能成功感染細胞,為BDV的基礎研究提供了更有力的技術方法。2.免疫共沉淀得到的差異蛋白質(zhì)結(jié)果可做后續(xù)實驗分析,我們篩選到了453個與BDV-P相互作用和259個與BDV-N相互作用的候選蛋白質(zhì),這些數(shù)據(jù)為深入研究BDV-P/N與宿主結(jié)合致病機制和作用方式提供了線索。以期能篩查出BDV與人類精神疾病發(fā)生聯(lián)系的蛋白質(zhì),進一步探討B(tài)DV的發(fā)病機制。3.在PPI分析中,提取部分相關蛋白質(zhì)之間的連接用于進一步的相關分析。我們推測ACBP(DBI)與BDV-P結(jié)合,可能參與BDV感染宿主后致焦慮的過程。4.另外結(jié)合生物信息學的分析和文獻的報道,我們推測,第一:BDV-P蛋白質(zhì)參與組胺H1/H2受體介導的信號傳導途徑,可能是BDV感染后焦慮和記憶損傷的關鍵。第二,BDV-P蛋白質(zhì)的Slit/Robo軸突導向分子與腫瘤的關系,感染BDV后可能會抑制膠質(zhì)瘤侵襲。
【圖文】：

圖 1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 OL 細胞的鑒定A. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后熒光檢測；B. 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后 P40 和 P24 蛋白表達驗證。Figure 1 Detection of post transfection in SH-SY5Y cells.AFluorescence expression of GFP at 24h post-transfection in SH-SY5Y cells. B Expression oP40 and P24 proteins detected by WB.2.2 病毒滴度檢測結(jié)果慢病毒 LV5-P24 和 LV5-P40 感染 293T 細胞滴度見圖 2。結(jié)果可見構(gòu)建的慢病毒能成功感染 293T 細胞，熒光顯微鏡計數(shù)熒光細胞，結(jié)合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度最終測出病毒滴度為 1×109TU/mL。

圖 2 熒光檢測慢病毒滴度Figure 2 lentivirus titers were detected by fluorescence.病毒感染原代神經(jīng)元結(jié)果組化的熒光染色結(jié)果表明（圖 3-A）： 我們所培養(yǎng)的原代神經(jīng)被以 MAP-2 抗體識別, 發(fā)出特異性的紅熒光，可達 60%～80細胞核發(fā)出藍光，表明所培養(yǎng)的細胞主要為神經(jīng)元。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373

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本文編號：2691438