【摘要】：各類內(nèi)源物質(zhì)和外源化合物在人體內(nèi)的代謝是一個十分復雜的過程,過去人們認為這種代謝可以分為兩步完成。即由細胞色素氧化酶P450(CYPs)為主要代謝酶催化的一相代謝反應(yīng)和由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)為主要代謝酶催化的二相代謝反應(yīng)。一般認為,CYPs的主要作用是對藥物分子進行結(jié)構(gòu)修飾,例如在分子結(jié)構(gòu)上加上一個羥基,使其更為親水。而UGTs的主要作用是在一相代謝的基礎(chǔ)上,將輔因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA)上的葡萄糖醛酸基團轉(zhuǎn)移到藥物分子的羥基上,使藥物水溶性提高,更利于通過尿液或膽汁排出體外。但是最新研究表明,化合物在體內(nèi)的代謝并非嚴格遵守一相至二相的順序,大多情況下,二者是同時并存關(guān)系。更有可能有些物質(zhì)只經(jīng)過CYPs代謝就排出體外,也有些本身就帶有羥基集團的化合物不經(jīng)過CYPs催化,直接經(jīng)由UGTs代謝后排出體外。UGTs是非常重要的藥物代謝酶,可以代謝將近35%的藥物,使之失活。除藥物外,UGTs還可以介導致癌物質(zhì)的解毒過程,以及維持體內(nèi)內(nèi)源物質(zhì),如激素和膽紅素的體內(nèi)平衡。前文提到,UGTs的代謝解毒原理主要為在底物分子的羥基基團上連接葡萄糖醛酸基團,使產(chǎn)物親水性提高,因而更易通過尿液或膽汁排出體外。這個過程需要輔因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸提供葡萄糖醛酸基團。UGTs的底物結(jié)構(gòu)十分多樣化,除羥基外,含有羰基,羧基,巰基以及氨基的化合物都可以成為底物。事實上,整個反應(yīng)為R-OH(或R-CO,R-COOH,R-SH,R-NH2)作為親核試劑的SN2親核取代反應(yīng),最終形成了更為親水的產(chǎn)物β-D-葡糖苷酸。UGTs之所以具有多樣化的底物結(jié)構(gòu),最主要的原因是UGTs是一個具有多個同工酶的超家族。人類UGT酶有22種同工酶,可被分為四個家族,UGT1A、UGT2(可分為UGT2A和UGT2B)、UGT3和UGT8。其中UGT1A和UGT2B家族的UGT同工酶承擔了大部分的外源物質(zhì)代謝解毒過程。它們也是需要著重考慮的酶。因此,了解這些酶在體內(nèi)的分布及表達十分有助于藥物代謝的毒理學研究。肝臟作為最主要的代謝器官,多種UGT同工酶都在其中表達。其中,UGT1A家族的一些同工酶(1A1,1A4,和1A9)和UGT2B家族的一些同工酶(2B4,2B7,和2B15)表達水平相較于其他高出許多。但是其他同工酶,如UGT1A3,1A6,2B10,2B11和2B17的表達量為中等水平。而UGT1A5,1A7,1A8,1A10和2B28表達水平極低。胃腸道也是UGT酶催化代謝的主要場所,在藥物的代謝過程中發(fā)揮重要作用。UGT1A1,1A4,2B7以及2B15在胃腸道中表達量相較其他較高,而UGT1A3,1A7,1A8,1A9,2B4,2B7,2B10,2B11和2B28在胃腸道中表達量極低。除此之外,腎臟中的代謝過程也是藥物解毒排出體外不可缺少的環(huán)節(jié)。腎臟中,表達水平最高的為UGT1A6,1A9以及2B7。藥物代謝意義上的藥物與藥物間相互作用是指一種藥物對代謝另一種藥物的代謝酶產(chǎn)生了影響,從而造成另一種藥物在人體內(nèi)累積而致使其濃度升高超過治療窗,產(chǎn)生毒性。UGTs在藥物代謝中發(fā)揮極其重要的作用。因此,近年來因UGTs功能受到影響而導致的藥物與藥物相互作用相關(guān)報道屢見不鮮。例如,丙戊酸作為一種抗癲癇和抗抑郁藥物,服用后對人體內(nèi)UGT2B7功能具有抑制作用。而UGT2B7為一系列藥物(包括撲熱息痛,阿莫三嗪,齊多呋定)的主要代謝酶。丙戊酸與這些藥物的同時服用無疑會導致這些藥物在人體內(nèi)的代謝過度積累,從而引起毒副作用。除藥物與藥物相互作用外,因遺傳性的基因差別而導致藥物代謝途徑發(fā)生改變同樣會造成藥物的藥理學性質(zhì)發(fā)生變化。而UGTs是一類遺傳性差異發(fā)生頻率很高的代謝酶。UGTs的單核苷酸多態(tài)性以及基因拷貝數(shù)變異普遍存在于不同人種間,因其造成的藥物代謝過程差異同樣是人們關(guān)注研究的重點。因變異導致的UGTs功能降低或缺失與多種疾病及藥物毒性反應(yīng)存在聯(lián)系。例如,抗癌藥物依替立康的抗癌療效主要依賴于其在人體內(nèi)的初始代謝物SN-38,而SN-38在具有極高的抗癌活性同時,其對血細胞的毒副作用也十分明顯。而SN-38在體內(nèi)代謝過程主要由一些UGT1As負責,因此UGT1As因變異導致的功能缺失會造成SN-38的體內(nèi)累積,產(chǎn)生嚴重的毒副作用,造成白細胞減少癥。此外,膽紅素水平是評判肝功能好壞的重要指標。其作為內(nèi)源物質(zhì),主要由UGT1A1進行代謝,而UGT1A1為目前已知的變異型最多的UGT同工酶。一些變異型會導致UGT1A1功能活性降低,從而使血液中膽紅素水平升高,有可能造成黃疸�，F(xiàn)今,研究各個UGT同工酶功能的方法有很多。較為常見的是使用人肝微粒和微生物或細胞系重組表達UGT酶作為酶源,來研究單個同工酶的活性區(qū)別。但這些方法各有利弊。人肝微粒的好處是,儲存及使用簡便,反應(yīng)時間短,適合高通量篩選底物。而其缺點亦十分明顯,人肝微粒造價昂貴,來源困難,存在批次差異,以及無法用于研究一些只在肝外表達的UGT同工酶。而另一種較為常用的方法是微生物(如大腸桿菌或酵母)重組表達人類UGTs。在本組之前的實驗研究中,曾用裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)成功共表達了人類19種UGT同工酶(UGT1A和UGT2家族)以及其輔因子尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDPGA),并基于此進行了一系列全細胞轉(zhuǎn)化實驗。優(yōu)點是因為共表達了輔因子,因此無需在反應(yīng)體系中人為投放輔因子,大大降低了實驗成本。但是這種全細胞轉(zhuǎn)化實驗缺點也很明顯。UGTs位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)側(cè),屬于膜蛋白。全細胞生物轉(zhuǎn)化方法中,因為完整細胞具有多層的生物屏障(如細胞壁、細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜),底物穿透這些屏障到達UGT酶位置進行生物反應(yīng)的過程受到阻礙,而生成的產(chǎn)物要經(jīng)過同樣的生物屏障排出細胞外。因而此種方法產(chǎn)率低,耗時長。為了克服這些缺點,在本項研究中,我們建立并優(yōu)化了基于滲透性重組表達人類UGTs的裂殖酵母的研究方法。此種方法將裂殖酵母細胞用適當滲透劑處理,使其表面細胞膜形成孔洞。這些孔洞大小可允許底物,輔因子以及產(chǎn)物分子自由進出,而UGTs因其分子結(jié)構(gòu)過大而留在細胞內(nèi),因而反應(yīng)時間縮短,產(chǎn)率提高,獲得更高效率比。我們將這種方法稱為酶包法。為了驗證酶包法的實行的可能性以及高效率,我們進行了一系列實驗。首先,因為滲透劑不但會對細胞膜產(chǎn)生影響,而且高濃度情況下還會影響酶的活性。因此,我們探究了一系列滲透劑濃度對UGT酶活性的影響,同時使用人肝微粒作為對照。基于本組之前的實驗研究,我們選擇Triton X-100作為滲透劑。研究結(jié)果表明相較于人肝微粒,遞增的Triton X-100濃度與UGT活性成正比,并在0.3%濃度時達到最高。因此在后續(xù)研究中,酶包法中Triton X-100濃度被固定為0.3%。此項試驗證明了酶包方法在運用于UGT酶上的可能性。隨后,為了證明酶包法的高效性,我們選取11α-羥基孕酮作為底物,分別進行酶包法轉(zhuǎn)化和全細胞轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示,酶包法獲得的產(chǎn)物為全細胞轉(zhuǎn)化法獲得產(chǎn)物的將近四十倍,這一數(shù)據(jù)有力證明了酶包法的高效性。接著,我們使用酶包法進行了酶活性抑制實驗,成功測定了甲芬那酸抑制UGT1A9的IC50值,所得數(shù)據(jù)(IC504.1μM,with a 95%CI of 2.5 to 6.4μM R2=0.97)與之前被發(fā)表過的數(shù)據(jù)十分接近。使用普羅麥格公司(Promega)提供的發(fā)光底物,我們成功為三種UGT同工酶(UGT1A5,UGT2B11,和UGT2B28)發(fā)現(xiàn)了新底物。同時,我們發(fā)現(xiàn)UGT1A5還可以催化氨基的葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移反應(yīng),這是從未被發(fā)現(xiàn)和報道過的。此外,對于UGT1A5錯義突變的生物信息學研究表明,UGT1A5有兩個之前從未被發(fā)現(xiàn)的變異型,其一為九倍突變(UGT1A5*8),其二為六倍突變(UGT1A5*9)。我們成功在裂殖酵母中表達了這兩種突變型,并以野生型UGT1A5作為對照,使用發(fā)光底物測試了其活性。結(jié)果表明,無論是O-葡萄糖醛酸化還是N-葡萄糖醛酸化,UGT1A5*8的活性總是高于UGT1A5*9和野生型UGT1A5。同源建模和分子底物對接研究表明,在所有突變中,UGT1A5*8中的Gly259Arg突變?yōu)殛P(guān)鍵性因素。該突變通過新形成的氫鍵網(wǎng),穩(wěn)定了helix Q的結(jié)構(gòu)。相較于野生型UGT1A5,該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定有助于輔因子與酶的結(jié)合。最后,因為體育競賽中興奮劑濫用情況日漸猖獗,而興奮劑的UGTs代謝產(chǎn)物在興奮劑檢測和監(jiān)控中起到重要作用,我們決定使用基于UGTs的酶包法對興奮劑的代謝情況進行一定研究。此次實驗中,我們使用酶包法研究了19種人類UGT酶對興奮劑普萘洛爾及其一相代謝產(chǎn)物4-羥基普萘洛爾的代謝情況。除了已被發(fā)現(xiàn)的UGT1A9,我們還發(fā)現(xiàn)了兩種新的UGT同工酶(UGT1A7和UGT1A8)也可以代謝普萘洛爾和4-羥基普萘洛爾。此外,4-羥基普萘洛爾還被另一種UGT同工酶(UGT2A1)代謝。更為有趣的是,我們還發(fā)現(xiàn)了UGT1A7,UGT1A8和UGT1A9均對普萘洛爾具有立體選擇性。
【學位授予單位】：天津大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R341

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本文編號：2692066