【摘要】：目的:鈣連蛋白(Calnexin,Canx)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白和重要的內(nèi)凝集素分子伴侶,監(jiān)控真核細胞蛋白折疊和裝配,調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+穩(wěn)態(tài)和Ca2+介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,參與多種重要生物學(xué)功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),日本血吸蟲(Schistosomaa jaaponicum,Sj)Canx(SjCanx)基因在不同宿主因子影響下的肺期童蟲中具有顯著的差異表達。本文初步研究該基因?qū)θ毡狙x童蟲生長發(fā)育的影響;同時克隆、表達其蛋白后,觀察重組蛋白的免疫保護作用,為探尋新的疫苗與藥物作用靶點提供基礎(chǔ)資料。方法:利用在線工具對SjCanx氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析,使用ClustalX2軟件對血吸蟲Canx及其它物種Canx氨基酸序列進行比對,利用Swiss Model在線工具繪制SjCanx三維模式圖,使用Mega 5.5 sofeware構(gòu)建SjCanx和其它物種同源物系統(tǒng)進化樹。收集日本血吸蟲不同發(fā)育期的蟲體,提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用Real-Time PCR法鑒定SjCanx基因在日本血吸蟲不同發(fā)育時期蟲體中的mRNA表達。設(shè)計并合成SjCanx基因的小干擾RNA(siRNA),在日本血吸蟲尾蚴經(jīng)機械斷尾轉(zhuǎn)化成童蟲后將其與童蟲共培養(yǎng),收集培養(yǎng)6 d的日本血吸蟲童蟲,一部分置于光鏡下觀察、拍照,并使用IPP6.0軟件對童蟲進行形態(tài)學(xué)統(tǒng)計分析;另一部分利用real-timePCR檢測目的基因的沉默效果。提取日本血吸蟲成蟲的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,根據(jù)SjCanx對應(yīng)的胞外段基因序列設(shè)計并合成特異性引物,以cDNA為模板擴增,目的基因與pET28a(+)質(zhì)粒進行雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化,挑取陽性克隆,PCR法檢測后測序鑒定;提取測序正確的質(zhì)粒DNA,將其轉(zhuǎn)化入原核表達宿主菌BL21;挑取陽性克隆,用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達,SDS-PAGE、western blot檢測表達結(jié)果,免疫磁珠法純化重組蛋白(rSjCanx)。用純化獲得的rSjCanx免疫新西蘭家兔,獲取多克隆抗血清,免疫組織化學(xué)法定位目的基因在童蟲中的分布。將rSjCanx免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后感染日本血吸蟲尾蚴30±1條,42天后解剖小鼠,灌注法沖蟲收集日本血吸蟲成蟲,摘取0.5 g左葉肝臟組織勻漿、消化后收集蟲卵,顯微鏡下計數(shù),計算減蟲率和減卵率;取黃豆大小右葉肝臟組織固定、HE染色,測量單個蟲卵形成的肉芽腫面積,計算面積減小率(與對照組比較);同時眼底靜脈采血,收集血清,ELISA夾心法測定Th1型和Th2型細胞因子IL-4和IFN-γ的含量。結(jié)果:生物信息學(xué)分析顯示,SjCanx的分子式為C2949H4528N782O907S18,為穩(wěn)定性親水跨膜蛋白,與SmCanx的同源性較高,相似率達84%。Real-time PCR法檢測SjCanx基因在不同發(fā)育時期蟲體中的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其mRNA在感染3 d的肺期童蟲中表達水平最高、蟲卵中最低。siRNA作用后,培養(yǎng)6 d的干擾組童蟲其體長、體寬、面積及體積分別為145.79±26.08μm、53.25±9.56μm、(2.88±0.67)×104μm2、(20.88±7.42)×104μm3,均顯著小于對照組的 159.36±35.74 μm、56.33±9.45μm、(3.30±0.73)×104μm2、(25.62±9.27)×104μm3(P0.05);Real-time PCR結(jié)果顯示,SjCanx基因的沉默效率為55.4%(P0.05)。根據(jù)SjCanx胞外段對應(yīng)基因序列,設(shè)計的上游引物為CGGGATCCAATCCTGAGTTAGAAC CTGAAG、下游引物為 CCGCTCGAGTTTCTCATTGTAAGTTTCCCG,構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET28a(+)-SjCanx,獲得的rSjCanx經(jīng)western-blotting檢測發(fā)現(xiàn)其大小與理論分子量一致,約為53.5 kDa。rSjCanx免疫家兔,獲取的抗血清經(jīng)ELISA法測定其滴度達1:12800。免疫組化結(jié)果顯示,SjCanx基因主要定位于童蟲的實質(zhì)和表膜。免疫保護結(jié)果發(fā)現(xiàn),rSjCanx免疫組誘導(dǎo)的減蟲率10.36%(P0.05)、減卵率為30%(P0.05),單個蟲卵導(dǎo)致的肝肉芽腫面積為(0.157 ±0.036)×105 um2,比佐劑組的肉芽腫面積減小23%(P0.05)。ELISA法檢測各組血清的細胞因子結(jié)果顯示,IFN-y和IL-4在空白對照組、佐劑組與rSjCanx免疫組分別為 19.75±5.38 pg/ml 和 7.56±1.92 pg/ml、22.05±5.05 pg/ml 和 7.600±2.53 pg/ml,37.33±8.07 pg/ml和7.65±2.18 pg/ml;統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),免疫組小鼠血清IFN-y顯著高于佐劑組(P0.05),但IL-4無顯著差異(P0.05)。結(jié)論:SjCanx基因沉默后影響了童蟲的生長發(fā)育,提示SjCanx在童蟲生長發(fā)育過程中具有重要作用;克隆表達了SjCanx胞外段對應(yīng)基因的rSjCanx;rSjCanx可產(chǎn)生30%的減卵率,其機制可能是通過增強Th1型細胞因子IFN-y免疫應(yīng)答來實現(xiàn)。
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３．實驗結(jié)果逡逑３．１邋ＳｙＣａｎｘ基因的生物信息學(xué)分析逡逑■ＳｙＣａｎｘ基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果見圖３．１。如圖３．１所示，汾Ｃａｎｘ屬于逡逑Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ超家族。沒Ｃａｎｘ基因的開放閱讀框長度為１７４９邋ｂｐ，編碼一個５８２個逡逑氨基酸殘基的蛋白，相對分子量為６６ｋＤｓ，編碼產(chǎn)物見表３．１，預(yù)測等電點為逡逑ｐＨ５．０６，＞５／Ｃａｎｘ的氨基酸組成和含量分析見表３．２。由表３．２可知，，汾Ｃａｎｘ由Ｃ、逡逑Ｈ、Ｎ、０、Ｓ五種原子組成，共有９１８４個原子，分子式為Ｃ２９４９Ｈ４５２８Ｎ７８２0９0７ＳＩ８；逡逑估計半衰期．？在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞體外為３０小時；在酵母體內(nèi)大于２０小時；逡逑在大腸桿菌細胞體內(nèi)為大于１０小時。由該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為３５．７０，可知為穩(wěn)定逡逑蛋白。利用Ｅｘｐａｓｙｐｒｏｔｓｃａｌｅ分析蛋白疏水性結(jié)果見圖３．２。如圖３．２所不，該蛋逡逑白為親水蛋白。ＳｉｇｎａｌＰ４．１預(yù)測分顯示，l挘茫幔睿行藕烹

本文編號：2689590