【摘要】：背景及目的人誘導(dǎo)多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是一類具有自我更新能力、體外無限增殖和多向分化潛能特點的細胞,目前在醫(yī)學研究中應(yīng)用廣泛。iPSCs分化為的各種體細胞可用于建立體外疾病模型,在運動神經(jīng)元疾病的研究中,如何批量培養(yǎng)iPSCs并誘導(dǎo)其分化為高純度的運動神經(jīng)元為首先需要解決的問題。iPSCs的培養(yǎng)體系根據(jù)有無飼養(yǎng)層可分為有飼養(yǎng)層和無飼養(yǎng)層兩種體系,有飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系為傳統(tǒng)的干細胞培養(yǎng)體系,目前研究的神經(jīng)分化方案多于該體系中進行,但有飼養(yǎng)層細胞在維持干細胞狀態(tài)的同時也存在異源性污染的風險;而無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系為近些年為了干細胞應(yīng)用于臨床而逐漸興起的培養(yǎng)體系,其可以避免異源性細胞的污染,但長期在此種體系下培養(yǎng)的iPSCs的特性需進一步探究。本實驗旨在有無飼養(yǎng)層兩種體系中培養(yǎng)iPSCs,并結(jié)合先前有飼養(yǎng)層體系中的運動神經(jīng)元誘導(dǎo)方案,在無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中,嘗試誘導(dǎo)iPSCs定向分化為運動神經(jīng)元,并比較兩種體系中的分化效率,為后期優(yōu)化分化方案提供依據(jù)。材料與方法1、實驗分組:根據(jù)培養(yǎng)體系不同將實驗分為2組:(1)有飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系:小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)在本體系中作為飼養(yǎng)層細胞支持iPSCs生長;(2)無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系:Matrigel作為介質(zhì)促進iPSCs貼壁并支持細胞生長,mTeSR1作為無飼養(yǎng)層培養(yǎng)基。2、iPSCs的培養(yǎng):將iPSCs分別接種于MEF飼養(yǎng)層細胞及Matrigel上,連續(xù)培養(yǎng)5代后,光鏡下觀察細胞形態(tài),細胞免疫熒光鑒定多能性標記物SOX2,OCT4的表達。3、iPSCs向運動神經(jīng)元的分化:通過不同的小分子化合物組合誘導(dǎo)iPSCs分化28天獲得成熟的運動神經(jīng)元(motor neuron,MN),光鏡下觀察細胞形態(tài),細胞免疫熒光鑒定分化各階段細胞:神經(jīng)上皮細胞(neuroepithelial progenitors,NEP),運動神經(jīng)元前體細胞(motor neuron precursor cells,MNP),運動神經(jīng)元細胞,并對NEP及MNP細胞進行細胞計數(shù);qRT-PCR檢測NEP及MNP相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平,并進行比較。結(jié)果1、在兩種培養(yǎng)體系中,iPSCs表現(xiàn)出不同的細胞克隆形態(tài),通過傳代培養(yǎng)均可維持其典型的細胞形態(tài),并高表達多能性標記物SOX2,OCT4。2、兩種培養(yǎng)體系下,iPSCs定向分化的NEP、MNP、MN均各自表達其特異性標記物。3、有飼養(yǎng)層體系中NEP細胞SOX1,HOXA3及MNP細胞OLIG2,OCT4基因表達明顯高于無飼養(yǎng)層(P0.01),PAX6及SOX2表達無統(tǒng)計學差異(P0.05)。結(jié)論:1、在MEF作為飼養(yǎng)層及無飼養(yǎng)層兩種培養(yǎng)體系下,iPSCs可長期增殖并維持其多能性。2、無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系中的iPSCs可以有效的分化為運動神經(jīng)元,但其分化效率低于有飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系。3、有飼養(yǎng)層細胞可能分泌了某些無飼養(yǎng)層體系中缺乏的因子促進了神經(jīng)分化,對這些因子進行排查,可進一步優(yōu)化無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系。
【圖文】：

Cs 光鏡下細胞形態(tài)層體系中，iPSCs 呈克隆狀生長，克隆為卵圓形，克隆邊，可多層堆積，細胞核較大，核仁清晰，有較高的核質(zhì)iPSCs 扁平貼壁生長，形成不規(guī)則的細胞克隆，克隆內(nèi)細核質(zhì)比（圖 1.1）。

圖 1.2 iPSCs 多能性標記物免疫熒光染色論Cs 的多能性及無限增殖特性的維持需外來因子的干預(yù)F 細胞分泌的生長因子，細胞因子和細胞外基質(zhì)如 TG-511 和玻連蛋白 6 等均可維持干細胞的特性[31,32]，同細胞分化的催化劑，隨著細胞增殖，MEF 細胞可以度生長及融合，從而預(yù)防細胞分化。然而，MEF 作，其弊端也不應(yīng)忽視：①增加了工作量；②可能會胞；③它可能產(chǎn)生干細胞和成纖維細胞的混合培養(yǎng)臨床的應(yīng)用。異種細胞是支原體污染的常見來源，必需的營養(yǎng)物質(zhì)，支原體污染可能影響細胞生理學表型，核型和細胞因子表達的誘導(dǎo)。這些感染往往影響實驗結(jié)果。為了預(yù)防異種污染，有研究者提出培養(yǎng) iPSCs，但使用人源飼養(yǎng)細胞時，病毒和非病毒
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2689325