【摘要】：寨卡病毒(Zika virus)是一種再出現(xiàn)的蟲媒病毒,屬于黃病毒科黃病毒屬。寨卡病毒最早于1947年在烏干達(dá)寨卡森林的恒河猴血液中分離得到,因此得名。2007年,寨卡病毒在非洲和亞洲地區(qū)出現(xiàn)局部性流行,但其并未導(dǎo)致嚴(yán)重疾病,且感染病例報(bào)告數(shù)少于20次。然而,自2015年以來(lái),巴西、委內(nèi)瑞拉等拉美地區(qū)接連發(fā)生寨卡病毒暴發(fā)流行,發(fā)病人數(shù)高達(dá)200萬(wàn),并且導(dǎo)致了嚴(yán)重的并發(fā)癥,包括感染孕婦的胎兒先天性畸形(小頭畸形(Microcephaly)和胎兒死亡)以及成人格林巴利綜合征,引起全世界的廣泛關(guān)注。寨卡病毒自發(fā)現(xiàn)60余年以來(lái),只有少數(shù)病例被零星報(bào)道,且臨床癥狀輕微,所以一直未受重視。寨卡患者的臨床癥狀與同為蚊媒傳播的登革熱類似,其主要表現(xiàn)為發(fā)熱、斑丘疹、關(guān)節(jié)疼痛、結(jié)膜炎等,絕大多數(shù)患者經(jīng)對(duì)癥治療后可在七天內(nèi)恢復(fù)健康。而此次小頭畸形等嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的出現(xiàn),已經(jīng)超出了我們對(duì)蟲媒黃病毒的固有認(rèn)知,盡快闡明寨卡病毒致病機(jī)制迫在眉睫。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,寨卡病毒分為非洲世系和亞洲世系。2015-2016年間,在美洲地區(qū)暴發(fā)大流行且引起嚴(yán)重疾病的寨卡病毒株屬于亞洲世系。寨卡病毒的大規(guī)模暴發(fā)可能是由許多潛在機(jī)制驅(qū)動(dòng)造成的,包括因遺傳變化導(dǎo)致其獲得較強(qiáng)的神經(jīng)毒力和蚊蟲感染能力。最近有研究表明寨卡病毒PrM蛋白上的單個(gè)氨基酸絲氨酸取代天冬酰胺,可增強(qiáng)其致胎鼠小頭畸形的能力和對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的感染能力,這在分子水平上闡明了寨卡病毒在進(jìn)化過(guò)程中神經(jīng)毒力逐漸增強(qiáng)的機(jī)制。也有報(bào)道稱,寨卡病毒NS1非結(jié)構(gòu)蛋白的A188V突變可增強(qiáng)病毒在蚊蟲體內(nèi)的復(fù)制能力,并影響其介導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-β)產(chǎn)生的能力,從而增強(qiáng)寨卡病毒對(duì)宿主的致病性。我們的研究發(fā)現(xiàn)寨卡病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5上的第114位氨基酸在2015年以前高度保守,之后則由甲硫氨酸(M)突變成了纈氨酸(V)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的單個(gè)氨基酸替代(M114V)能增強(qiáng)寨卡病毒穿越血胎屏障的能力,同時(shí)可降低病毒對(duì)Ⅰ型干擾素的拮抗能力。進(jìn)一步闡明寨卡病毒在不斷的進(jìn)化過(guò)程中,逐漸獲得了對(duì)宿主的致病毒性和高適應(yīng)性,從而為解釋美洲大流行提供了重要依據(jù)。本研究主要分為以下兩部分。一、不同分離株的寨卡病毒與Ⅰ型干擾素反應(yīng)相互作用比較為了明確不同年代寨卡分離株對(duì)Ⅰ型干擾素的敏感性是否存在差異,我們選取了五株分離自不同時(shí)期的寨卡病毒進(jìn)行了系統(tǒng)比較。首先,對(duì)其IFN-a敏感性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,與早期寨卡分離株相比,當(dāng)前寨卡流行株的IFN-a敏感性更弱。其中寨卡病毒委內(nèi)瑞拉株(VEN/2016)對(duì)IFN-a的敏感性最弱,寨卡病毒柬埔寨株(CAM/2010)對(duì)IFN-a的敏感性最強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,VEN/2016的乳鼠神經(jīng)毒力顯著強(qiáng)于CAM/2010;VEN/2016感染免疫健全小鼠后,血清中的病毒載量明顯高于CAM/2010感染的小鼠;對(duì)于Ⅰ型干擾素受體缺陷型小鼠,兩株寨卡病毒感染導(dǎo)致的病毒血癥并無(wú)顯著性差異。由此推測(cè),兩株寨卡病毒之間存在的毒力差異可能與其對(duì)Ⅰ型干擾素的敏感性不同密切相關(guān)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,VEN/2016感染抑制了宿主細(xì)胞STAT2的表達(dá),從而導(dǎo)致磷酸化的STAT2顯著降低,抑制了Ⅰ型干擾素信號(hào)通路,而且VEN/2016拮抗Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的能力顯著強(qiáng)于CAM/2010。上述結(jié)果表明,與寨卡早期分離株相比,寨卡當(dāng)前流行株具有更強(qiáng)的拮抗Ⅰ型干擾素的能力。二、重組突變病毒M114V與野生型病毒體內(nèi)外模型的評(píng)價(jià)寨卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5是其編碼的最大蛋白,其N端的甲基轉(zhuǎn)移酶MTase的2’-O甲基化可以使病毒逃逸天然免疫的監(jiān)測(cè)。此外,已有研究表明寨卡病毒NS5蛋白能夠通過(guò)蛋白酶體降解人源性的STAT2,阻礙下游抗病毒蛋白的產(chǎn)生。為闡明不同年代寨卡分離株對(duì)IFN-α敏感性不同的機(jī)制,我們對(duì)包括VEN/2016以及CAM/2010在內(nèi)的45株寨卡病毒分離株編碼區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析,發(fā)現(xiàn)寨卡病毒NS5蛋白的第114位氨基酸在2015年以前高度保守,2015年以后由甲硫氨酸(M)進(jìn)化為纈氨酸(V)。推測(cè)寨卡病毒該位點(diǎn)的突變影響了寨卡病毒的致病性。通過(guò)反向遺傳學(xué)技術(shù),我們將NS5蛋白上的氨基酸差異位點(diǎn)引入CAM/2010的全長(zhǎng)感染性克隆,并通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的手段獲得了突變病毒M114V。進(jìn)一步在體內(nèi)外模型上對(duì)突變株病毒和野生型病毒(WT)進(jìn)行了比較。生物學(xué)特性方面,兩株病毒的蝕斑形態(tài)、在不同細(xì)胞系上的生長(zhǎng)曲線及E蛋白表達(dá)都不存在顯著性差異。WT在免疫健全129小鼠的血癥和臟器嗜性方面均強(qiáng)于M114V;在Ⅰ型干擾素受體缺陷型A129小鼠體內(nèi),兩種病毒的病毒血癥、臟器嗜性、體重和死亡率無(wú)顯著性差異。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,WT與M114V的體內(nèi)致病性差異與Ⅰ型干擾素有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),與M114V相比,WT顯著抑制了Ⅰ型干擾素信號(hào)分子STAT2的表達(dá),從而抑制了干擾素下游抗病毒蛋白的作用,最終導(dǎo)致WT對(duì)IFN-α的敏感性弱于M114V。免疫健全的孕鼠感染模型中,M114V在外周血的復(fù)制能力弱于WT,但對(duì)胎盤和胎腦的組織嗜性更強(qiáng)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,M114V在人和鼠的神經(jīng)細(xì)胞系的復(fù)制能力均強(qiáng)于WT。總體而言,M114V較之WT,感染正常小鼠后,可更快地在外周血中被清除,但M114V更易穿越血胎屏障進(jìn)入胎盤,而且一旦侵襲神經(jīng)組織,其復(fù)制能力則強(qiáng)于WT。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)寨卡當(dāng)前流行株和早期分離株對(duì)IFN-α的敏感性不同,通過(guò)生物信息學(xué)推測(cè)造成這種現(xiàn)象的原因:NS5蛋白的第114位氨基酸由甲硫氨酸(M)到纈氨酸(V)的替代可能導(dǎo)致了病毒毒力和致病能力的改變。我們通過(guò)體內(nèi)外模型分析比較了突變病毒和野生型病毒拮抗宿主Ⅰ型干擾素系統(tǒng)的能力,兩種病毒對(duì)小鼠的致病性及其在神經(jīng)組織中的復(fù)制能力,發(fā)現(xiàn)寨卡病毒流行進(jìn)化過(guò)程中,非結(jié)構(gòu)蛋白NS5第114位氨基酸由M到V的改變?cè)鰪?qiáng)了寨卡病毒穿越血胎屏障的能力和對(duì)胎鼠的致病性,這項(xiàng)研究對(duì)于深刻理解寨卡病毒的暴發(fā)和毒力進(jìn)化具有重要意義,同時(shí)也為后續(xù)抗寨卡病毒藥物和疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

第一部分 不同寨卡分離株的寨卡病毒與 I 型干擾素反應(yīng)相互作用比較2015 年的巴西流行株屬于亞洲世系（圖 1-1）。為了確定 20大流行前后的病毒株是否存在顯著的毒力差異，，我們選擇于亞洲世系、但分別流行于不同時(shí)期的寨卡病毒分離株，分Q/2015(GenBank KU647676)、POM/2013(GenBank KJ7767912/2016(GenBank KU8664232)、CAM/2010（GenBank KU955592016(GenBank KU820898)，通過(guò)比較它們對(duì)Ⅰ型干擾素的敏析寨卡大流行前后不同分離株對(duì)宿主天然免疫系統(tǒng)的拮抗

圖 1-2 不同的年代寨卡病毒株的干擾素敏感性-2 Interferon sensitivity in different generations of Zika virus st步確定不同寨卡病毒株之間確實(shí)存在這種干分別觀察了不同 IFN-α 劑量下（20、100、5CAM/2010 在細(xì)胞中的復(fù)制能力。用 MOI 5 的 感染 BHK-21 細(xì)胞，37 C 孵箱中培養(yǎng) 1hr 后理組為對(duì)照組），收集細(xì)胞上清測(cè)定病毒滴度手段檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果如圖所示，兩種病在劑量依賴性，當(dāng) IFN-α 濃度為 20 或 100U 復(fù)制的抑制效果顯著強(qiáng)于 VEN/2016。細(xì)胞病
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373

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