【摘要】：目的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)中的神經(jīng)元表現(xiàn)出其神經(jīng)元活動(dòng)的晝夜變化。并且我們也發(fā)現(xiàn)對(duì)SCN進(jìn)行輸入的神經(jīng)突觸也會(huì)表現(xiàn)出以一天為周期的節(jié)律性變化。光的有無(wú)是影響生物體晝夜節(jié)律最大的因素,并且谷氨酸是視網(wǎng)膜-下丘腦通路(retino-hypothalamic tract,RHT)上突觸末梢分泌的主要的神經(jīng)遞質(zhì)。在各類(lèi)型神經(jīng)元突觸中,我們發(fā)現(xiàn)谷氨酸能和GABA能突觸兩者的微型突觸后電流(miniature postsynaptic currents,mPSC)在頻率上的日常變化。其中,血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)神經(jīng)元作為在SCN腦區(qū)內(nèi)對(duì)晝夜節(jié)律有重要作用的神經(jīng)元,是可以直接接受RHT末梢表達(dá)的谷氨酸能信息的輸入。因此,我們想探討VIP神經(jīng)元對(duì)于SCN內(nèi)神經(jīng)元活動(dòng)的晝夜變化性質(zhì)是如何起到作用。方法1.小鼠腦片制備使用2-3個(gè)月大的C57/B6與VIP-ires-Cre::Rosa-GCaMP5轉(zhuǎn)基因小鼠用4%異氟烷麻醉后,快速完整地取出整腦(小鼠處于黑暗情況下則在昏暗紅光下進(jìn)行)。在NMDG切片液中切除300μm/片的冠狀面腦片,將含有SCN腦區(qū)的腦片在裝有細(xì)胞外液的腦片收集槽中以37℃水浴鍋中孵育45分鐘,并伴隨95%氧氣+5%二氧化碳的混合氣不斷向細(xì)胞外液中充氧。2.全細(xì)胞膜片鉗記錄在室溫下對(duì)SCN腦區(qū)內(nèi)GABA能和谷氨酸能突觸的mPSC進(jìn)行電生理記錄(使用不同的水浴溶液);轉(zhuǎn)基因鼠腦片使用波長(zhǎng)470 nm藍(lán)光激發(fā),可以在熒光顯微鏡下看到SCN內(nèi)VIP神經(jīng)元。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為了檢測(cè)突觸的微電流活動(dòng),記錄用高斯濾波器在Clampfit 10.7中以1 kHz進(jìn)行低通濾波進(jìn)行分析。用人體視覺(jué)檢查來(lái)評(píng)估檢測(cè)的質(zhì)量,如果假陽(yáng)性和假陰性事件的總數(shù)超過(guò)檢測(cè)事件數(shù)量的10%,則整個(gè)過(guò)程將重復(fù)使用新的方法分析。測(cè)量每個(gè)檢測(cè)到的突觸活動(dòng)的峰值幅度作為來(lái)自基線的峰值的局部最小值。通過(guò)將活動(dòng)數(shù)除以總時(shí)間來(lái)計(jì)算微型活動(dòng)的頻率。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。文中指出的n個(gè)值是記錄的細(xì)胞數(shù)量。mPSCs的平均頻率是來(lái)自每個(gè)細(xì)胞的微型事件頻率的平均值。平均mPSC幅度是每個(gè)細(xì)胞的平均峰值幅度的平均值。p0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.谷氨酸能mPSCs在黑暗期(0.57±0.12 Hz,n=27)明顯高于光亮期(0.24±0.05Hz,n=24),但是它們的峰值振幅在光(7.29±0.47pA,n=24)和暗相(6.93±0.51pA,n=27)之間沒(méi)有顯著差異;2.與光相(3.56±0.98Hz,n=13)相比,黑暗階段(1.14±0.14Hz,n=29)中GABA能mPSC的頻率顯著降低。與光相(3.56±0.98 Hz,n=13)相比,黑暗階段(1.14±0.14 Hz,n=29)GABA能mPSCs的頻率顯著降低,但是在光42.43±6.38 pA,n=13)和暗相(35.10±3.34 pA,n=29)其峰值幅度并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;3.小鼠在適應(yīng)jetleg(time shift 4 h),在適應(yīng)新光暗環(huán)境的第三天檢測(cè)小鼠SCN內(nèi)神經(jīng)元GABA能(Daytime:0.24±0.05Hz,n=24;Daytime(Dark):0.11±0.02Hz,n=13)和谷氨酸能(Daytime:3.56±0.98Hz,n=13;Daytime(Dark):2.85±0.58Hz,n=12)mPSC各自的頻率變化均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;4.在由暗相進(jìn)入光相的適應(yīng)階段,谷氨酸能(Night:0.40±0.14Hz,n=15;Night(Light):0.18±0.03Hz,n=15)mPSC量子釋放降低,GABA能(Night:1.46±0.27Hz,n=15;Night(Light):2.12±0.38Hz,n=14)mPSC量子釋放升高;5.轉(zhuǎn)基因VIP-cre:GCaMP5小鼠用于鑒定VIP神經(jīng)元,并且對(duì)VIP神經(jīng)元和非-VIP進(jìn)行記錄。在LD周期中,VIP神經(jīng)元與黑暗階段相比,在光照階段中谷氨酸能mPSC的頻率較高,GABA能mPSCs的頻率較低(谷氨酸能mPSC:0.42±0.14Hz,n=14[L]與0.85±0.28pA,n=11[D];GABA能mPSC:1.01±0.20Hz,n=11[L]對(duì)0.50±0.10Hz,n=11[D])。L和D分別是Light和Dark的簡(jiǎn)寫(xiě)。結(jié)論驗(yàn)證了外界光暗環(huán)境是影響SCN神經(jīng)元活動(dòng)的重要因素,量子事件的可塑性可能影響SCN神經(jīng)元在日常周期中的輸出,并且我們推測(cè)VIP神經(jīng)元電活動(dòng)的晝夜差異介導(dǎo)了SCN神經(jīng)元晝夜電活動(dòng)的差異。目的在神經(jīng)環(huán)路研究中,確定目標(biāo)神經(jīng)元的上游的有效方法就是逆向追蹤。病毒載體是對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)強(qiáng)大的基因遞送載體,但是大部分現(xiàn)在可用的工具逆行轉(zhuǎn)運(yùn)效率不高以及有限的臨床潛力。因此,我們應(yīng)用了新進(jìn)化的變種r AAV2-retro對(duì)視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)進(jìn)行有效的逆向追蹤,其效率可與傳統(tǒng)的合成逆行追蹤劑相媲美,并且能夠在靶向神經(jīng)元群體中進(jìn)行功能性回路詢(xún)問(wèn)和體內(nèi)基因組編輯的足夠的傳感器/效應(yīng)器表達(dá)。我們?cè)诖藢?duì)SCN上游進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。方法1.病毒注射健康成年Ai9轉(zhuǎn)基因小鼠按照體重注射1%戊巴比妥鈉使其麻醉。麻醉后,將小鼠固定在適配器上。然后剪開(kāi)頭皮,充分暴露小鼠前囪(bregma)點(diǎn)和人(lambda)字點(diǎn)。然后重新固定小鼠頭顱使bregma點(diǎn)和lambda點(diǎn)處于同一水平,根據(jù)圖譜標(biāo)記好顱骨上的位置并打孔。將微量注射器傾斜10°按照給定的坐標(biāo)注射。2.冰凍腦切片注射病毒三周后,對(duì)小鼠用4%多聚甲醛心臟灌流,取出全腦,在4%多聚甲醛后固定約20小時(shí),用30%蔗糖溶液脫水沉糖,脫水完成后,用冰凍切片機(jī)以50μm/片切取冠狀面腦片,玻片貼片后,用PBS清洗三遍,蓋上蓋玻片,封片。3.病毒觀察與拍片在熒光顯微鏡下觀察每張腦片的熒光表達(dá)情況,對(duì)照小鼠腦圖譜做好記錄。然后用共聚焦顯微鏡拍片。結(jié)果與結(jié)論我們觀察到的SCN的上游確定的核團(tuán)有:腹外側(cè)視前核,前皮質(zhì)杏仁核,前背側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核,下丘腦腹內(nèi)側(cè)核,膝狀體間小葉,韁核,后部丘腦室旁核,不確定區(qū)域,后部下丘腦弓狀核+后內(nèi)側(cè)部分下丘腦弓狀核,后內(nèi)側(cè)皮質(zhì)杏仁核,前外側(cè)部分海馬區(qū)杏仁核+后腹部?jī)?nèi)側(cè)杏仁核,后部基底中部杏仁核+后部基底側(cè)核杏仁核,外嗅皮層+顳葉聯(lián)合皮層,背側(cè)乳頭體核,下丘腦后區(qū),埃-韋二氏核。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R338
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本文編號(hào)：
2687342
