【摘要】：目的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)中的神經(jīng)元表現(xiàn)出其神經(jīng)元活動的晝夜變化。并且我們也發(fā)現(xiàn)對SCN進(jìn)行輸入的神經(jīng)突觸也會表現(xiàn)出以一天為周期的節(jié)律性變化。光的有無是影響生物體晝夜節(jié)律最大的因素,并且谷氨酸是視網(wǎng)膜-下丘腦通路(retino-hypothalamic tract,RHT)上突觸末梢分泌的主要的神經(jīng)遞質(zhì)。在各類型神經(jīng)元突觸中,我們發(fā)現(xiàn)谷氨酸能和GABA能突觸兩者的微型突觸后電流(miniature postsynaptic currents,mPSC)在頻率上的日常變化。其中,血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)神經(jīng)元作為在SCN腦區(qū)內(nèi)對晝夜節(jié)律有重要作用的神經(jīng)元,是可以直接接受RHT末梢表達(dá)的谷氨酸能信息的輸入。因此,我們想探討VIP神經(jīng)元對于SCN內(nèi)神經(jīng)元活動的晝夜變化性質(zhì)是如何起到作用。方法1.小鼠腦片制備使用2-3個月大的C57/B6與VIP-ires-Cre::Rosa-GCaMP5轉(zhuǎn)基因小鼠用4%異氟烷麻醉后,快速完整地取出整腦(小鼠處于黑暗情況下則在昏暗紅光下進(jìn)行)。在NMDG切片液中切除300μm/片的冠狀面腦片,將含有SCN腦區(qū)的腦片在裝有細(xì)胞外液的腦片收集槽中以37℃水浴鍋中孵育45分鐘,并伴隨95%氧氣+5%二氧化碳的混合氣不斷向細(xì)胞外液中充氧。2.全細(xì)胞膜片鉗記錄在室溫下對SCN腦區(qū)內(nèi)GABA能和谷氨酸能突觸的mPSC進(jìn)行電生理記錄(使用不同的水浴溶液);轉(zhuǎn)基因鼠腦片使用波長470 nm藍(lán)光激發(fā),可以在熒光顯微鏡下看到SCN內(nèi)VIP神經(jīng)元。3.統(tǒng)計學(xué)方法為了檢測突觸的微電流活動,記錄用高斯濾波器在Clampfit 10.7中以1 kHz進(jìn)行低通濾波進(jìn)行分析。用人體視覺檢查來評估檢測的質(zhì)量,如果假陽性和假陰性事件的總數(shù)超過檢測事件數(shù)量的10%,則整個過程將重復(fù)使用新的方法分析。測量每個檢測到的突觸活動的峰值幅度作為來自基線的峰值的局部最小值。通過將活動數(shù)除以總時間來計算微型活動的頻率。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。文中指出的n個值是記錄的細(xì)胞數(shù)量。mPSCs的平均頻率是來自每個細(xì)胞的微型事件頻率的平均值。平均mPSC幅度是每個細(xì)胞的平均峰值幅度的平均值。p0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.谷氨酸能mPSCs在黑暗期(0.57±0.12 Hz,n=27)明顯高于光亮期(0.24±0.05Hz,n=24),但是它們的峰值振幅在光(7.29±0.47pA,n=24)和暗相(6.93±0.51pA,n=27)之間沒有顯著差異;2.與光相(3.56±0.98Hz,n=13)相比,黑暗階段(1.14±0.14Hz,n=29)中GABA能mPSC的頻率顯著降低。與光相(3.56±0.98 Hz,n=13)相比,黑暗階段(1.14±0.14 Hz,n=29)GABA能mPSCs的頻率顯著降低,但是在光42.43±6.38 pA,n=13)和暗相(35.10±3.34 pA,n=29)其峰值幅度并沒有統(tǒng)計學(xué)差異;3.小鼠在適應(yīng)jetleg(time shift 4 h),在適應(yīng)新光暗環(huán)境的第三天檢測小鼠SCN內(nèi)神經(jīng)元GABA能(Daytime:0.24±0.05Hz,n=24;Daytime(Dark):0.11±0.02Hz,n=13)和谷氨酸能(Daytime:3.56±0.98Hz,n=13;Daytime(Dark):2.85±0.58Hz,n=12)mPSC各自的頻率變化均沒有統(tǒng)計學(xué)差異;4.在由暗相進(jìn)入光相的適應(yīng)階段,谷氨酸能(Night:0.40±0.14Hz,n=15;Night(Light):0.18±0.03Hz,n=15)mPSC量子釋放降低,GABA能(Night:1.46±0.27Hz,n=15;Night(Light):2.12±0.38Hz,n=14)mPSC量子釋放升高;5.轉(zhuǎn)基因VIP-cre:GCaMP5小鼠用于鑒定VIP神經(jīng)元,并且對VIP神經(jīng)元和非-VIP進(jìn)行記錄。在LD周期中,VIP神經(jīng)元與黑暗階段相比,在光照階段中谷氨酸能mPSC的頻率較高,GABA能mPSCs的頻率較低(谷氨酸能mPSC:0.42±0.14Hz,n=14[L]與0.85±0.28pA,n=11[D];GABA能mPSC:1.01±0.20Hz,n=11[L]對0.50±0.10Hz,n=11[D])。L和D分別是Light和Dark的簡寫。結(jié)論驗證了外界光暗環(huán)境是影響SCN神經(jīng)元活動的重要因素,量子事件的可塑性可能影響SCN神經(jīng)元在日常周期中的輸出,并且我們推測VIP神經(jīng)元電活動的晝夜差異介導(dǎo)了SCN神經(jīng)元晝夜電活動的差異。目的在神經(jīng)環(huán)路研究中,確定目標(biāo)神經(jīng)元的上游的有效方法就是逆向追蹤。病毒載體是對神經(jīng)系統(tǒng)強(qiáng)大的基因遞送載體,但是大部分現(xiàn)在可用的工具逆行轉(zhuǎn)運(yùn)效率不高以及有限的臨床潛力。因此,我們應(yīng)用了新進(jìn)化的變種r AAV2-retro對視交叉上核(suprachiasmatic nucleus,SCN)進(jìn)行有效的逆向追蹤,其效率可與傳統(tǒng)的合成逆行追蹤劑相媲美,并且能夠在靶向神經(jīng)元群體中進(jìn)行功能性回路詢問和體內(nèi)基因組編輯的足夠的傳感器/效應(yīng)器表達(dá)。我們在此對SCN上游進(jìn)行觀察和統(tǒng)計。方法1.病毒注射健康成年Ai9轉(zhuǎn)基因小鼠按照體重注射1%戊巴比妥鈉使其麻醉。麻醉后,將小鼠固定在適配器上。然后剪開頭皮,充分暴露小鼠前囪(bregma)點和人(lambda)字點。然后重新固定小鼠頭顱使bregma點和lambda點處于同一水平,根據(jù)圖譜標(biāo)記好顱骨上的位置并打孔。將微量注射器傾斜10°按照給定的坐標(biāo)注射。2.冰凍腦切片注射病毒三周后,對小鼠用4%多聚甲醛心臟灌流,取出全腦,在4%多聚甲醛后固定約20小時,用30%蔗糖溶液脫水沉糖,脫水完成后,用冰凍切片機(jī)以50μm/片切取冠狀面腦片,玻片貼片后,用PBS清洗三遍,蓋上蓋玻片,封片。3.病毒觀察與拍片在熒光顯微鏡下觀察每張腦片的熒光表達(dá)情況,對照小鼠腦圖譜做好記錄。然后用共聚焦顯微鏡拍片。結(jié)果與結(jié)論我們觀察到的SCN的上游確定的核團(tuán)有:腹外側(cè)視前核,前皮質(zhì)杏仁核,前背側(cè)內(nèi)側(cè)杏仁核,下丘腦腹內(nèi)側(cè)核,膝狀體間小葉,韁核,后部丘腦室旁核,不確定區(qū)域,后部下丘腦弓狀核+后內(nèi)側(cè)部分下丘腦弓狀核,后內(nèi)側(cè)皮質(zhì)杏仁核,前外側(cè)部分海馬區(qū)杏仁核+后腹部內(nèi)側(cè)杏仁核,后部基底中部杏仁核+后部基底側(cè)核杏仁核,外嗅皮層+顳葉聯(lián)合皮層,背側(cè)乳頭體核,下丘腦后區(qū),埃-韋二氏核。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R338

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉覲龍,宿雙寧,韓湘文;與作業(yè)無關(guān)的新異刺激對獼猴額葉神經(jīng)元延緩期反應(yīng)的作用[J];生理學(xué)報;1988年05期

2 劉覲龍,宿雙寧;獼猴額葉神經(jīng)元視辨別機(jī)能可塑性的研究[J];生理學(xué)報;1989年05期

3 劉覲龍,韓湘文,宿雙寧;大腦額葉神經(jīng)元在痛覺和針剌鎮(zhèn)痛中的作用[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1989年10期

4 高美蘭;張均明;劉蔭仁;;電刺激兔尾核頭部對中腦網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)痛敏神經(jīng)元電活動的影響及與針效關(guān)系[J];針刺研究;1989年04期

5 ;神經(jīng)元活動控制胼胝體纖維投射模式的研究取得新進(jìn)展[J];生命科學(xué);2007年06期

6 ;刺激耳廓可調(diào)節(jié)與攝食有關(guān)的下丘腦神經(jīng)元活動[J];國外醫(yī)學(xué)(中醫(yī)中藥分冊);1994年06期

7 ;新裝置可觀測神經(jīng)元活動[J];傳感器世界;2013年05期

8 王如彬;張志康;;關(guān)于耦合神經(jīng)元活動時的能量原理[J];生物物理學(xué)報;2005年06期

9 周迪勛，邢更生，周毓菁，王暄;人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)神經(jīng)元活動狀態(tài)的鑒別[J];武漢工業(yè)大學(xué)學(xué)報;1995年03期

10 張祥鏞;動物行為中不同腦區(qū)神經(jīng)元活動的比較[J];華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);1992年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 胡三覺;王玉英;;噪聲對神經(jīng)元活動基本性質(zhì)的影響[A];中國神經(jīng)科學(xué)學(xué)會第六屆學(xué)術(shù)會議暨學(xué)會成立十周年慶祝大會論文摘要匯編[C];2005年

2 王梓印;王如彬;;基于H-H模型的神經(jīng)能量計算與神經(jīng)元活動狀態(tài)的能量判據(jù)[A];第二屆全國神經(jīng)動力學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2014年

3 鄭洪雯;王如彬;;關(guān)于神經(jīng)能量的分子神經(jīng)動力學(xué)[A];中國力學(xué)大會——2013論文摘要集[C];2013年

4 魯捷;;美啟動大腦阿波羅計劃:繪制10萬神經(jīng)元活動地圖[A];《科學(xué)與現(xiàn)代化》2017年第1期（總第070期）[C];2017年

5 惠麗紅;張曉東;何超;劉茜瑋;謝晟;肖江喜;王霄英;;GESSE序列的志愿者評價研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第16次全國放射學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2009年

6 李春燕;趙東琴;艾洪濱;崔希云;;石榴皮提取物抑制束縛-浸水應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠胃腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)元活動[A];中國生理學(xué)會第23屆全國會員代表大會暨生理學(xué)學(xué)術(shù)大會論文摘要文集[C];2010年

7 王如彬;鄭錦超;張志康;;神經(jīng)信息用神經(jīng)能量表達(dá)的思考[A];第一屆全國神經(jīng)動力學(xué)學(xué)術(shù)會議程序手冊 & 論文摘要集[C];2012年

8 林劍萍;趙華;;褪黑素(MEL)對韁核內(nèi)痛反應(yīng)神經(jīng)元活動的影響[A];中國生理學(xué)會第21屆全國代表大會暨學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

9 劉春紅;張宇;李峰;鐵常樂;王傳躍;馬辛;;健康成年伴失眠癥狀者島葉及丘腦自發(fā)神經(jīng)元活動減低[A];中華醫(yī)學(xué)會第十八次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編（上）[C];2015年

10 胡新天;;獼猴大腦運(yùn)動系統(tǒng)編碼策略的研究[A];Proceedings of the 8th Biennial Conference of the Chinese Society for Neuroscience[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前1條

1 記者 聶翠蓉;美首繪水�；铙w神經(jīng)元活動完整圖譜[N];科技日報;2017年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 張衡;PV神經(jīng)元中的ErbB4介導(dǎo)Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性：對阿爾茨海默病的啟示[D];浙江大學(xué);2017年

2 王瑩;酒精對線蟲作用的分子機(jī)理及神經(jīng)元功能成像研究[D];華中科技大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 曹秦禹;磁流作用下Pre-B(?)tizinger復(fù)合體神經(jīng)元的動力學(xué)分析[D];北方工業(yè)大學(xué);2018年

2 黃旭;SCN腦區(qū)VIP神經(jīng)元的電活動晝夜變化及小鼠SCN腦區(qū)的逆向追蹤[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

3 張濤;信鴿OT中間層ON-OFF神經(jīng)元SUN刺激編碼研究[D];鄭州大學(xué);2018年

4 宋楠;延髓五羥色胺神經(jīng)元持續(xù)內(nèi)向電流構(gòu)成及五羥色胺的調(diào)控研究[D];華東師范大學(xué);2018年

5 郭升莉;電磁場作用下神經(jīng)元動力學(xué)行為研究[D];蘭州理工大學(xué);2018年

6 呂密;電磁輻射下神經(jīng)元的建模及其動力學(xué)分析[D];蘭州理工大學(xué);2017年

7 任曉暄;針刺對下丘腦促性腺激素釋放激素神經(jīng)元活動的影響[D];中國中醫(yī)研究院;2005年

8 趙勝男;尼古丁對大鼠下丘腦室旁核小細(xì)胞神經(jīng)元活動的影響[D];延邊大學(xué);2015年

9 鄧云;神經(jīng)核團(tuán)的同步分析與有效連接估計[D];天津大學(xué);2016年

10 喬U_城;去甲腎上腺素對腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核神經(jīng)元活動的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

，

本文編號：2687342