【摘要】：目的通過分離培養(yǎng)年輕和老年小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs),對細(xì)胞的形態(tài)、表型、細(xì)胞凋亡及自噬水平進(jìn)行比較,探究自噬在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老過程中發(fā)揮的作用,并進(jìn)一步對相關(guān)信號通路蛋白進(jìn)行研究,并且對相關(guān)的分子調(diào)節(jié)通路進(jìn)行深入分析。方法選取健康的清潔級年輕C57小鼠(8周齡)和老年C57小鼠(18個(gè)月齡),在無菌環(huán)境中分離股骨、脛骨,體外分離BM-MSCs,并培養(yǎng)至第3代,通過光學(xué)顯微鏡觀察兩組細(xì)胞形態(tài)。采取流式細(xì)胞術(shù)檢測對兩組BM-MSCs細(xì)胞表型進(jìn)行測定,進(jìn)一步運(yùn)用TUNEL染色標(biāo)記兩組BM-MSCs凋亡的狀況。使用ELISA試劑盒對兩組BM-MSCs細(xì)胞旁分泌因子VEGF、bFGF、IGF-1、HGF的表達(dá)水平的檢測。Western Blotting檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62及信號通路相關(guān)蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR的表達(dá)。結(jié)果在顯微鏡下觀察年輕組及老年組BM-MSCs,細(xì)胞均呈典型的纖維樣梭形生長。兩組BM-MSCs表型表達(dá)鑒定呈CD90、CD29陽性,CD31、CD45陰性,提示兩組BM-MSCs表型表達(dá)無明顯差異;與年輕組BM-MSCs比較,老年組BM-MSCs的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)增多,提示凋亡情況上升(P0.05);同時(shí)老年組BM-MSCs旁分泌因子VEGF、bFGF、IGF-1、HGF的表達(dá)水平下降(P0.05),提示衰老BM-MSCs旁分泌功能明顯降低;進(jìn)一步Western Blotting檢測老年組BM-MSCs自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5表達(dá)水平下降,而p62蛋白表達(dá)水平呈增加趨勢(P0.05),提示在衰老BM-MSCs自噬的程度下降;與年輕組BM-MSCs相比,老年組BM-MSCs信號通路相關(guān)蛋白p-Akt、p-mTOR表達(dá)增多(P0.05)。結(jié)論老年組BM-MSCs細(xì)胞形態(tài)及表型與年輕組BM-MSCs無明顯差別。老年組BM-MSCs細(xì)胞凋亡增多,旁分泌功能減弱,自噬水平下降,同時(shí)Akt/mTOR通路磷酸化水平上升,提示衰老可能通過活化Akt/mTOR通路參與自噬調(diào)節(jié),導(dǎo)致自噬活性下降,進(jìn)一步影響細(xì)胞衰老的發(fā)展進(jìn)程。
【圖文】：

略顯稀疏(圖 1A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測 BM-MSCs 細(xì)胞表BM-MSCs 表面標(biāo)志物 CD31、CD45 呈陰性，CD90 和 CD29 呈流式細(xì)胞術(shù)檢測老年組 BM-MSCs 這四種細(xì)胞表型，結(jié)果顯示Cs 細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD31、CD45 表達(dá)呈陰性，CD90、CD29 兩組 BM-MSCs 細(xì)胞表型表達(dá)無明顯差異(圖 1 B)。

來測定兩組BM-MSCs的細(xì)胞凋亡情況(圖2A)。免疫熒光鏡下觀察細(xì)胞，，DAPI 染色顯示兩組 BM-MSCs 的細(xì)胞總數(shù)無明顯差別，TUNEL 染色顯示老年組 BM-MSCs 中凋亡細(xì)胞較年輕組明顯增多，統(tǒng)計(jì)顯示年輕組 BM-MSCs 凋亡率為 12.58±1.21%，老年組 BM-MSCs 凋亡率為37.83±3.43%(圖 2B)，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)過 t 檢驗(yàn)分析，提示老年組 BM-MSCs 細(xì)胞凋亡高于年輕組 BM-MSCs 細(xì)胞凋亡(P<0.05)。
【學(xué)位授予單位】：錦州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R363

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