【摘要】：目的:瘙癢作為一種引起人強(qiáng)烈不適的感覺,常常出現(xiàn)在各種不同的慢性皮膚病中,而銀屑病和干皮病的典型癥狀就是瘙癢,它嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)作為一種模式識別受體常常在免疫疾病中發(fā)揮作用,但已有數(shù)據(jù)表明TLRs也參與了瘙癢疼痛,因此本文聚焦于TLR2和銀屑病、干皮病,探究TLR2和慢性癢之間的關(guān)系。首先檢測銀屑病和干皮病小鼠模型中TLR2m RNA及蛋白的變化,然后通過藥理學(xué)、行為學(xué)、分子生物學(xué)等方法,探究TLR2信號通路調(diào)控慢性瘙癢的分子機(jī)制。方法:1在野生型小鼠和TLR2 KO小鼠頸背部注射CQ、Compound 48/80、Substance P、ET-1,觀察小鼠搔抓行為,檢測急性癢變化。2將野生型小鼠分為兩組,一組不做處理,另一組建立慢性癢模型;TLR2 KO小鼠分為兩組,一組不做處理,另一組建立慢性癢模型。造模過程中在特定時間點(diǎn)觀察小鼠搔抓行為,檢測自發(fā)癢和觸誘發(fā)癢變化。造模七天后取皮膚組織,運(yùn)用HE染色技術(shù)檢測皮膚的病理變化;運(yùn)用實(shí)時定量PCR、Western blotting技術(shù)檢測TLR2 m RNA、蛋白表達(dá)量;運(yùn)用Q-PCR技術(shù)檢測趨化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL7、CXCL8和趨化因子受體CXCR1、CXCR2的m RNA變化量。3將野生型小鼠分為兩組,一組不做處理,另一組建立慢性癢模型。造模七天后,在兩組小鼠頸背部皮內(nèi)注射CXCR1、CXCR2的抑制劑,觀察小鼠搔抓行為,檢測瘙癢變化。4將野生型小鼠隨機(jī)分組,在小鼠的頸部通過皮內(nèi)注射分別給予小鼠CQ、CQ+CXCR1/2的抑制劑混合液,Compound 48/80,Compound 48/80+CXCR1/2的抑制劑的混合液。每組6-10只,觀察小鼠搔抓行為,檢測急性癢變化。5應(yīng)用Western blotting技術(shù)確定PGN-SA孵育Ha Ca T細(xì)胞系后p65和p38磷酸化情況。6在Ha Ca T細(xì)胞系中先孵育p65和p38的抑制劑后再用PGN-SA孵育Ha Ca T細(xì)胞系,運(yùn)用實(shí)時定量PCR技術(shù)確定趨化因子CXCL1、CXCL8的表達(dá)情況。7小鼠頸背部皮內(nèi)注射趨化因子CXCL8,觀察搔抓行為,檢測CXCL8誘導(dǎo)急性癢情況。8將野生型小鼠用咪喹莫特處理建立慢性癢小鼠模型,造模成功后隨機(jī)分為三組,在頸背部分別皮內(nèi)注射生理鹽水、0.1μg趨化因子CXCL8、0.3μg趨化因子CXCL8,觀察搔抓行為,檢測CXCL8能否增加慢性癢小鼠模型的瘙癢。結(jié)果:1轉(zhuǎn)棒、熱板、甩尾、von Frey以及腳底注射福爾馬林行為學(xué)結(jié)果顯示,TLR2缺失后運(yùn)動功能無變化,痛閾增加。2 TLR2基因敲除小鼠后能降低CQ、Compound 48/80、Substance P、ET-1誘發(fā)的瘙癢。3咪喹莫特乳膏和AEW處理后,TLR2基因敲除小鼠慢性癢模型中,瘙癢減少,皮膚厚度變薄。4 Q-PCR和Western blotting結(jié)果顯示,慢性癢模型皮膚中TLR2 m RNA、蛋白表達(dá)量增加,DRG中CXCR1、CXCR2的m RNA表達(dá)上調(diào)。TLR2基因敲除小鼠中,緩解了皮膚中CXCL1、CXCL8 m RNA的上調(diào)。5皮內(nèi)注射CXCR1/2的抑制劑Reparixin及CXCR2的拮抗劑SB225002能降低銀屑病和干皮病模型的自發(fā)癢。6皮內(nèi)注射CXCR1/2的抑制劑Reparixin及CXCR2的拮抗劑SB225002能減少CQ、Compound 48/80誘發(fā)的抓撓次數(shù)。7 Q-PCR和Western blotting結(jié)果顯示,PGN-SA孵育Ha Ca T細(xì)胞系后P-p65和P-p38蛋白、CXCL1及CXCL8 m RNA表達(dá)上調(diào)。8 Q-PCR結(jié)果顯示,用NF-κB抑制劑PDTC抑制p65磷酸化可緩解PGN-SA導(dǎo)致的Ha Ca T細(xì)胞系CXCL1、CXCL8 m RNA表達(dá)上調(diào)。9皮內(nèi)注射趨化因子CXCL8可誘發(fā)急性癢,低劑量趨化因子CXCL8增加銀屑病和干皮病模型的自發(fā)癢。結(jié)論:1 TLR2參與急性癢和慢性癢2 TLR2通過NF-κB信號通路調(diào)控皮膚角質(zhì)細(xì)胞CXCL1、CXCL8的表達(dá)3 TLR2可能通過調(diào)控CXCL1、CXCL8介導(dǎo)慢性癢。
【圖文】：

圖 1 TLR2 對小 礎(chǔ) 影 。（A）轉(zhuǎn)棒檢測 WT 和 TLR2 KO 運(yùn)動功能（B ）熱板和（C）甩尾檢測 WT 和 TLR2 KO 熱 應(yīng)。（D-E）von Frey 檢測WT 和 TLR2 KO 械 應(yīng)。（F-G）足 注射福爾馬 檢測 WT 和 TLR2 KO

Toll 樣受體 2 介導(dǎo)慢性癢的機(jī)制研究性 應(yīng)。（n=6-8；*P < 0.05；**P < 0.01；非 對 t 檢驗(yàn)；所 數(shù)據(jù)均以Mean±SEM 表 ）3.2 TLR2 介導(dǎo)小鼠的急性癢為了驗(yàn)證 TLR2 KO 是否參與小鼠的急性癢反應(yīng)，我們在小鼠頸部進(jìn)行皮內(nèi)分別注射 CQ、Compound 48/80、Substance P、ET-1 等致癢劑。結(jié)果顯示：與野生型小鼠相比，TLR2 KO 鼠中 CQ、Compound 48/80、Substance P、ET-1 誘發(fā)的抓撓次數(shù)降低（t=2.163，P=0.0451；t=2.161，P=0.0444；t=2.898，P=0.0083；t=2.556，，P=0.0198；圖 2 A-D），表明 TLR2 敲除后能夠緩解急性癢。第3章 結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R338

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本文編號：2686679