發(fā)布時間：2020-05-28 21:33

【摘要】：目的:骨骼肌成肌細(xì)胞移植治療心梗為病人帶來了希望,但在移植治療過程中,心肌組織缺血缺氧環(huán)境下出現(xiàn)的氧化應(yīng)激會導(dǎo)致移植細(xì)胞的凋亡,嚴(yán)重影響治療效果。本實(shí)驗(yàn)擬建立體外L6骨骼肌成肌細(xì)胞(L6 Skeletal Myobalst,L6SKM)H_2O_2損傷模型,過表達(dá)和抑制microRNA-214(miR-214),研究在氧化應(yīng)激條件下成肌細(xì)胞的凋亡變化并探討其調(diào)控機(jī)制。方法:細(xì)胞接種于6孔板中,制備細(xì)胞爬片或接種于培養(yǎng)瓶中,24h后進(jìn)行miR-214轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染后繼續(xù)孵育24小時,然后300μmol/L H_2O_2作用4h。實(shí)驗(yàn)分六組:H_2O_2組、正常對照組、mi R-214前體+H_2O_2組(pre-miR-214+H_2O_2組)、miR-214前體空白+H_2O_2組(pre-scramble+H_2O_2組)、miR-214抑制劑+H_2O_2組(anti-miR-214+H_2O_2組)、miR-214抑制劑空白+H_2O_2組(anti-scramble+H_2O_2組)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài),SP法檢測細(xì)胞色素C(Cytochrome C,cyt-c)表達(dá);DAPI染色顯示mi R-214對H_2O_2損傷L6SKM細(xì)胞凋亡的影響;Western blotting法檢測各組PTEN的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測以上各組及加入人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,pten)抑制劑組后L6SKM的凋亡率。結(jié)果:1.miR-214對H_2O_2損傷L6SKM細(xì)胞生長及凋亡的影響顯微鏡下顯示,正常組L6SKM生長旺盛,cyt-c免疫染色顯示細(xì)胞質(zhì)中可見散在點(diǎn)狀的棕黃色顆粒,分布均勻。細(xì)胞核為圓型或橢圓形,染色質(zhì)分布均勻;H_2O_2組細(xì)胞生長緩慢,部分L6SKM皺縮,細(xì)胞間隙增寬。cyt-c陽性呈彌漫性片狀分布,表達(dá)明顯高于對照組,部分細(xì)胞出現(xiàn)異染色質(zhì)邊集或碎裂,凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加;pre-mi R-214+H_2O_2組的L6SKM生長狀態(tài)明顯好于H_2O_2處理組,cyt-c表達(dá)明顯低于H_2O_2組,而細(xì)胞凋亡率明顯低于H_2O_2組;anti-mi R-214+H_2O_2組細(xì)胞生長狀態(tài)明顯不如H_2O_2處理組,細(xì)胞固縮死亡數(shù)目增加。Cyt-c表達(dá)明顯高于H_2O_2組。DAPI顯示凋亡率也高于H_2O_2組。2.miR-214對H_2O_2損傷L6SKM中PTEN蛋白表達(dá)的影響Western bolt檢測顯示,H_2O_2處理引起PTEN表達(dá)明顯增高,而與H_2O_2組相比,mi R-214的過表達(dá)顯著降低了PTEN表達(dá),抑制mi R-214的表達(dá)使PTEN表達(dá)顯著升高。3.流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率H_2O_2組細(xì)胞凋亡率(39.47±1.89)明顯高于對照組(7.55±0.42),P0.05;pre-miR-214+H_2O_2組細(xì)胞凋亡率(18.57±0.97)明顯低于H_2O_2組(39.47±1.89),P0.05;anti-mi R-214+H_2O_2細(xì)胞組(41.16±2.21)略高于H_2O_2組,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但其晚期凋亡率相對明顯升高;pre-miR-214+pten inhibitor+H_2O_2組細(xì)胞凋亡率(11.12±0.95)顯著低于pre-mi R-214+H_2O_2組(18.57±0.97),P0.05;anti-miR-214+pten inhibitor+H_2O_2組細(xì)胞凋亡率(17.63±0.73)顯著低于anti-miR-214+H_2O_2組(41.16±2.21),P0.05。結(jié)論:1.miR-214過表達(dá)可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡。2.miR-214通過下調(diào)PTEN,增強(qiáng)PI3K/Akt信號通路活性,達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用。
【圖文】：

檢測轉(zhuǎn)染后 microRNA-214 的表達(dá)，*P<0.05 vNA-214 expression of L6 myoblast after transfecmethod *P<0.05 vs normal

檢測轉(zhuǎn)染后 microRNA-214 的表達(dá)，，*P<0.05 vsRNA-214 expression of L6 myoblast after transfectimethod *P<0.05 vs normal
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

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