【摘要】：目的： 評價傳統(tǒng)的無血清饑餓法同步化對數(shù)生長期人外周血淋巴細胞以及Molt-4細胞的效果。 方法： 將在體外培養(yǎng)處于對數(shù)生長期的人外周血淋巴細胞和Molt-4細胞轉到無血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24、48h。收集細胞,流式細胞術檢測不同時間點細胞的凋亡(Annexin-V/PI)、增殖(Ki67)和Cyclin E的表達水平。 結果： 隨著體外饑餓時間的延長(24、48h),對數(shù)生長期的人外周血淋巴細胞凋亡率由(32.27±2.90)%增加到(61.82±2.47)%；ki67陽性率由(67.20±8.54)%減少到(51.87±0.59)%;G1期CyclinE+細胞的比例由饑餓前的(63.35±4.99)%分別減少至(46.04±1.84)%和(44.46%±2.97)%；S期細胞比例由饑餓前的(12.43±1.42)%分別增加到(16.73±0.96)%和(20.70±1.86)%；G2/M期細胞的比例由饑餓前的(1.49±0.98)%分別增加到(5.18±1.00)%和(8.06±1.38)%。 將對數(shù)生長期的Molt-4細胞轉入無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24、48h后也得到了類似的結果。 結論： 按照傳統(tǒng)的無血清饑餓法操作,將對數(shù)生長期的人外周血淋巴細胞以及對數(shù)生長期的Molt-4細胞轉移到無血清培養(yǎng)基中饑餓24、48h,盡管凋亡率增加,增殖率下降,但是饑餓48h的時候處于S期的細胞比例依舊高達20%,并未同步化至靜止期。所以傳統(tǒng)的無血清饑餓法并不能使對數(shù)生長期的細胞完全同步化。 目的： 在非同步化的正常人淋巴細胞中探索細胞周期限制點(Restriction Point, R-point)存在的真實性,為其存在于G1期而非GO期提供證據(jù)。 方法： 新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、18、24h后一部分轉入低血清(1%FBS)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h。收集細胞,流式細胞術檢測CyclinE表達,分析G1-cyclinE-、Gl-cyclinE+、S和G2/M各期陽性細胞比例；另一部分轉入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,流式細胞術通過檢測CyclinE表達,分析G1-cyclinE-、Gl-cyclinE+、S和G2/M各期陽性細胞比例、G0/G1期中P21表達,同時檢測細胞的增殖(Ki67)以及DNA摻入(BrdU)水平。 結果： 1、新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)0、12、18、24、48h后,S期比例增加,靜止期的細胞逐漸進入細胞周期。 2、新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12、18、24h后分別轉入低血清(1%FBS)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,此過程中S期細胞比例在13%到24%不等,不能實現(xiàn)同步化細胞的緩慢釋放進入細胞周期。 3、新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,盡管G1期細胞有75%左右表達CyclinE,但并未有細胞進入S期；18h后轉入無血清培養(yǎng)基中,S期、G2/M分別有19%、2%左右細胞表達CyclinE;24h后轉入無血清培養(yǎng)基中,S期、G2/M中CyclinE的表達率則分別有23%和3.7%左右。 4、新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,細胞Ki67陽性表達率僅有(7.83±1.36)%,18h和24h則分別增加到(21.89±2.72)%和(39.98±7.51)%。 5、新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h, BrdU摻入率僅有(2.18±1.37)%,而18h和24hBrdU摻入率則分別增加到(5.23±0.53)%和(12.06±3.49)%。 6、新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后轉入無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至滿48h,G0/G1期細胞P21陽性表達率為(82.45±4.61)%,而18h和24h則分別降到(49.89±19.11)%和(41.09±15.55)%。 結論： 1、新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后會逐漸進入細胞周期,作為細胞周期限制點的研究對象更加科學合理。 2、新鮮分離的人外周血淋巴細胞在含有1%PHA的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)后轉入低血清(1%FBS)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),此過程中S期細胞始終保持較高比例,不能實現(xiàn)同步化細胞的緩慢釋放進入細胞周期,所以轉入低血清(1%FBS)培養(yǎng)基中無法完成細胞周期限制點的研究。 3、本研究首次證實,在非同步化的正常人外周血淋巴細胞中確實也存在細胞周期限制點,且存在于G1期而非GO期。對于經過1%PHA刺激的人外周血淋巴細胞來說,其細胞周期限制點的定位可表現(xiàn)在1%PHA刺激生長12h到18h之間。
【圖文】：

新鮮分離的人外周血淋巴細胞調亡率為5.44%左右，細胞活力較好，此狀態(tài)可以滿足后續(xù)實驗的要求。如圖1-1。寸 PBL-0h-a.001■?—：，“ S ■.： ：.?人■ ■ I ?-Vcvi . - ? *N ： — 二T" ： .於：。三； ■ ■ ■■:■■■ 110 10 10 10FL1-HQuad °/o Qated % TotalUL O.OO O.OOUR 0.91 0.47"LL 94.56 48.81LR 4.53 2.34圖1-1新鮮分離的人外周血淋巴細胞調亡檢測結果2、無血清饑餓法同步化對數(shù)生長期人外周血淋巴細胞24、48h后調亡(Annexin V/PI)檢測結果(1)對數(shù)生長期人外周血淋巴細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后調亡率為(32.27±2.90) %，與對照組（7.35±0.30) %相比，差異有統(tǒng)計學意義（PO.OOl，/=14.82)。如圖 1-2-1。(2)對數(shù)生長期人外周血淋巴細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后調亡率為(61.82±2.47)%，與對照組（8.60±1.27)相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，/=33.18)。如圖1-2-2。(3)對數(shù)生長期人外周血淋巴細胞培養(yǎng)24、48小時后調亡率結果統(tǒng)計圖

-3對數(shù)生長期人外周血淋巴細胞培養(yǎng)24、48h后洞亡檢測結果統(tǒng)計圖
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【共引文獻】

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本文編號：2685588