發(fā)布時(shí)間：2017-03-26 09:12

  本文關(guān)鍵詞：一種肺泡巨噬細(xì)胞靶向的多表位結(jié)核粘膜疫苗，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis, TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)感染引起的以肺部慢性肉芽腫炎癥病變?yōu)橹鞯穆詡魅静�。結(jié)核菌經(jīng)呼吸道傳播,其自然感染率非常高,雖僅有5%的自然感染人群會(huì)產(chǎn)生活動(dòng)性肺結(jié)核及后續(xù)緩慢發(fā)作的肺結(jié)核干酪楊壞死和空洞型肺結(jié)核,95%的感染人群處于潛伏感染狀態(tài),在免疫力下降或空氣環(huán)境因素等變化,很容易進(jìn)展為活動(dòng)性肺結(jié)核,同時(shí)人群傳播極快。肺結(jié)核是十九-二十世紀(jì)間發(fā)病廣泛、傳染迅速、病程漫長(zhǎng)、嚴(yán)重?fù)p傷健康與勞動(dòng)力的感染性疾病。1919年前后,法國(guó)細(xì)菌學(xué)家Calmette和Guerin受牛痘疫苗的啟發(fā),將牛型結(jié)核桿菌(Mycobacterium bovis)在培養(yǎng)基傳代230次,獲得一株毒力顯著減弱的減毒牛型結(jié)核桿菌------卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG)是用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗,經(jīng)人體免疫試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)具有良好的預(yù)防肺結(jié)核功能�？ń槊绲陌l(fā)明和全球接種使肺結(jié)核不再成為老百姓聞之色變的嚴(yán)重傳染病。隨后多種抗菌素的發(fā)現(xiàn)、利福平、異煙肼等化學(xué)抗菌藥物的出現(xiàn),使肺結(jié)核的治療非常有效。然而上世紀(jì)80年代起,由于多重耐藥結(jié)核菌株的出現(xiàn)導(dǎo)致一線抗結(jié)核化學(xué)藥物失效、及卡介苗在控制肺結(jié)核療效的不穩(wěn)定甚至失效,人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)合并結(jié)核菌感染等問(wèn)題的出現(xiàn),肺結(jié)核重新成為再現(xiàn)(re-emerging)的嚴(yán)重傳染病,并位居世界三大傳染病之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)((2014年全球結(jié)核病報(bào)告》顯示,2013年全球900萬(wàn)人新染結(jié)核病,其中印度和中國(guó)分占24%和11%(100萬(wàn)),150萬(wàn)人死亡,其中36萬(wàn)為艾滋病患者。雖然從1990～2013年間肺結(jié)核的患病率與死亡率已顯著降低了41%和45%,但其發(fā)病總數(shù)提示肺結(jié)核仍未有效控制。由于卡介苗僅能預(yù)防兒童原發(fā)性結(jié)核和肺外結(jié)核,對(duì)于耐藥及多耐藥結(jié)核菌的控制仍無(wú)好的方法,全球人口流動(dòng)持續(xù)增高,因此防控結(jié)核病的重心仍舊應(yīng)當(dāng)定位于預(yù)防性結(jié)核疫苗的改良、創(chuàng)新研制和全球接種。研制新型結(jié)核疫苗具有重要的意義。結(jié)核疫苗研制的最重要基礎(chǔ)和最大障礙在于迄今對(duì)于天然抗結(jié)核免疫保護(hù)機(jī)制和疫苗抗結(jié)核免疫保護(hù)評(píng)價(jià)指標(biāo)仍有不解和爭(zhēng)議。與目前大多數(shù)成功抗感染疫苗的保護(hù)機(jī)制(如乙肝預(yù)防性疫苗)所顯著不同的是,抗結(jié)核免疫保護(hù)的中心法則是主要依賴(lài)T細(xì)胞免疫而不是抗體。在T細(xì)胞免疫中,最初認(rèn)為是分泌IFN-γ的CD4+Th1細(xì)胞,通過(guò)激活肺泡巨噬細(xì)胞吞噬小體成熟酸化及與溶酶體融合、自噬小體形成與有效降解、iNOS殺菌系統(tǒng)等機(jī)制充分殺滅結(jié)核分枝桿菌。然而關(guān)于IFN-γ的抗結(jié)核免疫保護(hù)功能近年產(chǎn)生很多爭(zhēng)議,全血IFN-γ水平甚至是潛伏結(jié)核進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核的危險(xiǎn)因素；BCG人群免疫后評(píng)估發(fā)現(xiàn)外周血IFN-γ+Th細(xì)胞頻率與免疫保護(hù)/肺結(jié)核進(jìn)展沒(méi)有相關(guān)性；IFN-γ還具有活化Treg和限制免疫應(yīng)答規(guī)模的免疫調(diào)控作用。TNF-α被發(fā)現(xiàn)與IΦN協(xié)同激活巨噬細(xì)胞合成NO并可限制肉芽腫病理組織規(guī)模減少組織病理?yè)p傷,在臨床發(fā)現(xiàn)具有阻止?jié)摲Y(jié)核進(jìn)展為活動(dòng)性肺結(jié)核的作用。而IL-2是重要的 細(xì)胞生長(zhǎng)因子。由此近年認(rèn)為同時(shí)分泌IFN-γ、 IL-2、TNF-α的多功能T細(xì)胞(multi-functional CD4+Th)才是結(jié)核免疫保護(hù)的關(guān)鍵。此外,CD8+T (CTL)細(xì)胞通過(guò)多種殺傷機(jī)制誘導(dǎo)感染的巨噬細(xì)胞凋亡,可使隱匿的結(jié)核菌有效釋放結(jié)核抗原激活特異性T細(xì)胞應(yīng)答。關(guān)于B細(xì)胞和抗體應(yīng)答在抗結(jié)核免疫保護(hù)的作用迄今爭(zhēng)議較大。B細(xì)胞分泌抗體IgG經(jīng)FcR調(diào)理、激活巨噬細(xì)胞等的吞噬殺傷功能、作為APC提呈結(jié)核抗原激活T細(xì)胞的功能發(fā)揮一定效應(yīng)。近年隨黏膜(局部)免疫與黏膜免疫器官的理論的提出和不斷重視,黏膜局部免疫微環(huán)境的多種免疫細(xì)胞與免疫分子的平衡對(duì)于控制感染、疾病進(jìn)展十分重要,如早期的肺泡局部嗜中粒細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞激活、IFN-γ產(chǎn)生；早中期的Th1、Th17、CTL浸潤(rùn)和殺傷功能增強(qiáng)；后期的Treg、IFN-γ、TNF-α等免疫調(diào)控應(yīng)答等。這些應(yīng)答均有別于全身(脾臟)免疫應(yīng)答。肺臟組織被認(rèn)為是一種新的黏膜免疫組織,存在獨(dú)特的支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT),其中含有結(jié)構(gòu)較為松散的T/B/DC等免疫細(xì)胞。Mtb感染肺泡巨噬細(xì)胞后,提呈抗原激活BALT中的Th細(xì)胞,進(jìn)而激活特異性B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞,活化的效應(yīng)B、T細(xì)胞通過(guò)趨化因子移動(dòng)至黏膜效應(yīng)局部,分泌SIgA,發(fā)揮T細(xì)胞效應(yīng),因此肺泡局部黏膜免疫很可能在抗結(jié)核免疫保護(hù)中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用。SIgA是人體黏膜部位的主要抗體類(lèi)別,其為雙體結(jié)構(gòu),中和活性顯著高于單體IgG,SIgA不僅可中和胞外游離的黏膜體液中的病原體,還可以經(jīng)pIgR受體主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞內(nèi),發(fā)揮胞內(nèi)中和作用；胞內(nèi)IgA病原復(fù)合物還可被TRIM21泛素化經(jīng)由蛋白酶體降解。研究提示呼吸道支氣管黏膜局部的SIgA對(duì)于中和胞外及胞內(nèi)Mtb,及調(diào)節(jié)其他抗結(jié)核保護(hù)免疫具有重要的意義。肺結(jié)核的防治迄今仍面臨很多未解的問(wèn)題,從增強(qiáng)黏膜免疫角度出發(fā),可從早期呼吸道及肺灌洗液SIgA的中和預(yù)防、肺黏膜局部多功能T細(xì)胞應(yīng)答的增強(qiáng),來(lái)顯著克服常規(guī)疫苗不能誘導(dǎo)的肺臟局部抗結(jié)核免疫,從黏膜局部免疫的新角度來(lái)實(shí)現(xiàn)更好的免疫保護(hù)效果。綜上,我們對(duì)于新型結(jié)核疫苗的設(shè)計(jì)理念聚焦于多特異性T細(xì)胞免疫和結(jié)核特異性黏膜免疫。為了誘導(dǎo)多抗原特異性T細(xì)胞免疫,我們將采用多表位核酸疫苗(poly-epitope vaccine)的策略,偶聯(lián)多個(gè)具有免疫原性的結(jié)核T細(xì)胞表位,包括CD4+和CD8+T細(xì)胞表位,試圖誘導(dǎo)多個(gè)結(jié)核抗原特異性的黏膜局部的T細(xì)胞應(yīng)答,通過(guò)攻擊結(jié)核菌多個(gè)靶抗原實(shí)現(xiàn)更好的免疫保護(hù)。為了誘導(dǎo)結(jié)核特異黏膜免疫,通過(guò)黏膜遞送載體制備和組裝一種易于通過(guò)黏膜、長(zhǎng)效釋放抗原的黏膜疫苗,并試圖發(fā)展新的分子策略來(lái)增強(qiáng)黏膜的靶向性；在多表位核酸疫苗分子設(shè)計(jì)上,針對(duì)抗原表位免疫原性很弱,我們選擇免疫原性非常強(qiáng)的蛋白作為載體支架,在其非功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)插入多個(gè)T細(xì)胞表位,使T細(xì)胞表位獲得一種良好的空間折疊與構(gòu)象,這一設(shè)計(jì)理念也被稱(chēng)為“多表位蛋白支架疫苗(poly-epitope in protein scaffold, PEPS)"設(shè)計(jì)。這一設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)和創(chuàng)新在于：1)就抗原數(shù)目種類(lèi)而言,偶聯(lián)了多個(gè)蛋白及表位；2)蛋白本身的強(qiáng)免疫原性保留；3)表位由于良好的空間呈現(xiàn),使得被APC吞噬后的酶類(lèi)降解更為有效精準(zhǔn)；4)多表位嵌合至蛋白中,可能產(chǎn)生很多新的B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。蛋白載體的選擇上,我們選擇了來(lái)源于Mtb的熱休克蛋白65 (heat-shock protein 65, HSP65)。HSP65是一種原核及真核生物的高度保守蛋白,是胞內(nèi)分子伴侶,可攜帶運(yùn)輸抗原、使避免降解并正確,最終促進(jìn)抗原的MHC提呈；最新研究表明HSP65可與APC如DC表面的TLR2/4作用,從而具有靶向DC并激活DC釋放RANTES等細(xì)胞因子功能,被認(rèn)為具有佐劑潛能。同時(shí)Mtb來(lái)源HSP65本身具有很強(qiáng)免疫原性和免疫保護(hù)特性。為此,我們選擇結(jié)核來(lái)源HSP65作為疫苗骨架蛋白,將多個(gè)結(jié)核T細(xì)胞表位插入其非功能結(jié)構(gòu)域,構(gòu)建以HSP65為骨架的多表位核酸疫苗(poly-epitope in protein scaffold vaccine, PES)在黏膜遞送載體選擇上,我們首先選擇脫乙酰殼聚糖(chitosan)這一具有無(wú)毒、緩釋、促進(jìn)黏膜吸附吸收等特性的天然陽(yáng)離子多糖,其可與DNA共凝集形成納米顆粒型復(fù)合物,不僅使抗原質(zhì)粒得以在黏膜局部緩釋,所形成的100-500nm大小的顆粒更易被黏膜局部的M細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等進(jìn)行吞噬,提高抗原攝取效率。運(yùn)用這一載體技術(shù),我們課題組前期曾成功制備了chitosan-DNA結(jié)核與病毒性心肌炎黏膜疫苗,均通過(guò)增強(qiáng)黏膜免疫提高了免疫保護(hù)。誘導(dǎo)肺黏膜特異性T細(xì)胞應(yīng)答及SIgA分泌可能是增強(qiáng)抗結(jié)核免疫保護(hù)的新思路。為了誘導(dǎo)全面的肺局部黏膜免疫,本課題設(shè)計(jì)制備了一種以結(jié)核優(yōu)勢(shì)抗原HSP65為支架、嵌合多個(gè)結(jié)核抗原T細(xì)胞表位的多T表位嵌合的蛋白支架DNA疫苗(pPES);在此基礎(chǔ)上,為高效誘導(dǎo)肺泡局部黏膜免疫以發(fā)揮更有效抗結(jié)核保護(hù),以天然陽(yáng)離子多糖-脫乙酰殼聚糖(chitosan, CS)為黏膜遞載體(佐劑),經(jīng)滴鼻免疫,誘導(dǎo)多抗原特異性肺黏膜免疫,并以大劑量BCG攻毒評(píng)估了其免疫保護(hù)效果。為進(jìn)一步提高該疫苗的黏膜靶向和抗原釋放效率,針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染肺泡巨噬細(xì)胞的特性,我們?cè)O(shè)計(jì)使用黏膜靶向分子---甘露糖,以甘露糖修飾的殼聚糖(mannosylated chitosan, MCS)組裝DNA疫苗,進(jìn)一步增強(qiáng)其黏膜免疫效果,以期接近甚至超過(guò)BCG的保護(hù)能力。本研究的創(chuàng)新性在于以誘導(dǎo)肺黏膜局部特異性免疫為目標(biāo)的一種新型黏膜疫苗設(shè)計(jì)平臺(tái)的建立。第一部分 多表位DNA疫苗的設(shè)計(jì)、構(gòu)建、表達(dá)與免疫原性鑒定1、以HSP65為骨架的嵌合多T表位核酸疫苗pPES的分子設(shè)計(jì)根據(jù)文獻(xiàn)我們選擇了5個(gè)結(jié)核分枝桿菌毒株H37Rv來(lái)源的T細(xì)胞表位,其中4個(gè)CD4+Th1表位ESAT-61-20(BCG缺失)、Ag85B244-255、PPE25241-255、PE194-18,1個(gè)CD8+CTL表位,MTB10.43-11,根據(jù)相似蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相容的原則,我們?cè)贖37Rv株來(lái)源的HSP65蛋白的第146、151、157、395位氨基酸后分別插入ESAT-61-20、Ag85B241-255、MTB10.43-11、PPE25241-255-AAY-PE194-18串聯(lián)表位。首先構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-HSP65,通過(guò)多次引物重疊延伸PCR,得到插入有5個(gè)T細(xì)胞表位的HSP65的PES基因片段,而后將其插入pcDNA3.1,得到pPES多表位結(jié)核疫苗質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切及DNA測(cè)序均證實(shí)構(gòu)建成功。構(gòu)建好的pPES序列經(jīng)二級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)分析,對(duì)載體HSP65基本二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響很小。作為多表位嵌合設(shè)計(jì)的對(duì)照,我們構(gòu)建了將表位直接串聯(lián)插入至pcDNA3.1中的質(zhì)粒p5pep,以及將表位串聯(lián)后插入HSP65末端的質(zhì)粒pHSP65-pep。2、HSP65蛋白的純化表達(dá)構(gòu)建pET32a HSP65質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化BL21,IPTG誘導(dǎo),并經(jīng)包涵體純化HSP65蛋白,純化蛋白純度大于90%,Western Blot鑒定和小鼠抗HSP65抗體特異結(jié)合。3、pPES質(zhì)粒的真核表達(dá)效率為驗(yàn)證p-PES質(zhì)粒的真核表達(dá)效率,將pPES轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,Western Blot轉(zhuǎn)膜并以抗HSP65抗體檢測(cè),證實(shí)pHSP65、pPES在體外真核細(xì)胞能夠高效表達(dá)HSP65蛋白(65kD)及PES蛋白(75kD)4、pPES疫苗誘導(dǎo)的特異T細(xì)胞應(yīng)答及與其他方式構(gòu)建疫苗的比較為證實(shí)我們構(gòu)建的嵌合有5個(gè)結(jié)核T細(xì)胞表位的HSP65載體多表位核酸疫苗的免疫原性,并比較這樣的蛋白載體嵌合表達(dá)與非嵌合式串聯(lián)表達(dá)、及無(wú)蛋白載體的表位串聯(lián)的免疫原性的差異,以pcDNA3.1、pHSP65、pPES、p5pep、 pHSP65-pep DNA疫苗以肌肉注射方式,免疫雌性C57BL/6小鼠股四頭肌,4次,間隔10天,每次50μg,總量200μg。末次免疫后10天取小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,用滅活H37Rv、HSP65蛋白、5種單獨(dú)表位多肽、5肽混合物分別進(jìn)行刺激,進(jìn)行IFN-γ的ELISPOT檢測(cè)。結(jié)果顯示：5種表位的簡(jiǎn)單串聯(lián)(p5pep)幾乎不能有效誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答；pHSP65只能對(duì)載體HSP65產(chǎn)生高效T應(yīng)答；5種表位串聯(lián)于HSP65羧基端(pHSP65-pep)可產(chǎn)生一定的T細(xì)胞免疫,但是5種表位嵌入HSP65的pPES疫苗對(duì)5種結(jié)核肽及混合肽均有更顯著增強(qiáng)的IFN-γ+T細(xì)胞免疫,且對(duì)BCG缺失的ESAT-61-20有良好反應(yīng),提示我們構(gòu)建的pPES疫苗確實(shí)比表位的其他構(gòu)建方式具有更好的誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)越性。5、pPES疫苗的免疫保護(hù)效果以1×107CFU BCG滴鼻攻毒4周,取小鼠肺石蠟切片行HE染色發(fā)現(xiàn)：pcDNA3.1載體組與p5pep組肺部呈現(xiàn)嚴(yán)重的肺結(jié)核炎癥,提示表位直接串聯(lián)無(wú)保護(hù)效果；pHSP65免疫組肺泡間隔增厚程度降低,具一定的免疫保護(hù)性；pHSP65-pep組的肺泡結(jié)構(gòu)與炎癥較前3組均有顯著降低；而pPES疫苗組顯示相對(duì)最佳的炎癥減輕的免疫保護(hù)效果。肺、脾臟菌落計(jì)數(shù)顯示：pPES疫苗降低臟器細(xì)菌生長(zhǎng)的效果最為顯著,由106.5和105.5顯著降至105.4和104.6,提示我們構(gòu)建的以HSP65為骨架的多表位核酸疫苗pPES相對(duì)其他方式構(gòu)建的多表位疫苗具有更好的免疫保護(hù)特性。第二部分脫乙酰殼聚糖組裝的結(jié)核DNA疫苗誘導(dǎo)的黏膜免疫與保護(hù)效果1、CS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的特異性體液免疫為明確CS-pPES疫苗滴鼻免疫能否誘導(dǎo)載體蛋白HSP65特異性抗體,以CS-vector陰性對(duì)照,CS-pHSP65, CS-pPES分別滴鼻免疫,BCG皮下注射作為陽(yáng)性對(duì)照,每只50μg DNA,隔周免疫4次。血清IgG水平方面：CS-vector對(duì)照組不能誘導(dǎo)血清IgG,其余各組均在6周起誘導(dǎo),第8周達(dá)到峰值。CS-pPES滴鼻免疫誘導(dǎo)了顯著高于對(duì)照組和CS-HSP65組的血清IgG,低于BCG組。提示在HSP65蛋白中插入5個(gè)結(jié)核表位并未顯著影響HSP65載體蛋白誘導(dǎo)抗體應(yīng)答的能力。為檢測(cè)CS-pPES滴鼻免疫是否能誘生黏膜SIgA,取末次免疫后兩周小鼠肺泡灌洗液(BAL)檢測(cè)顯示：CS-pPES疫苗滴鼻誘導(dǎo)了高水平的肺泡灌洗液SIgA,顯著高于各組,與BCG組無(wú)顯著差異。提示CS-pPES滴鼻免疫不僅可誘導(dǎo)血清IgG抗體,同時(shí)顯著誘導(dǎo)了HSP65特異性黏膜SIgA。2、CS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的特異性全身(脾臟)T細(xì)胞免疫為了檢測(cè)CS-pPES滴鼻免疫誘生的特異性T細(xì)胞免疫,取末次免疫后2周小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液,體外H37Rv、HSP65蛋白、5種表位多肽及5肽混合物分別刺激培養(yǎng)40h,進(jìn)行IFN-γ的ELISPOT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：CS-pPES組脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)所有結(jié)核抗原刺激均產(chǎn)生了較高水平IFN-γ+T細(xì)胞應(yīng)答,均高于CS-pHSP65和對(duì)照組(p0.05),但略低于BCG組；此外,僅有CS-pPES免疫小鼠脾細(xì)胞對(duì)Mtb特有而B(niǎo)CG缺失的ESAT-61-20有良好反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)了脾臟分泌多種細(xì)胞因子的T細(xì)胞頻率。經(jīng)滅活H37Rv刺激結(jié)果顯示：CS-pPES免疫小鼠脾細(xì)胞誘導(dǎo)了結(jié)核特異性分泌3種細(xì)胞因子的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,雖總體水平比BCG組略低,但均顯著高于對(duì)照和CS-pHSP65載體組(p0.05)。提示CS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫可顯著誘導(dǎo)脾臟CD4+和CD8+多功能T細(xì)胞應(yīng)答。3、CS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的特異性肺局部黏膜細(xì)胞免疫取末次免疫后2周小鼠肺臟淋巴細(xì)胞懸液,進(jìn)行IFN-γ的ELISPOT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：CS-pPES組肺臟淋巴細(xì)胞對(duì)幾乎所有結(jié)核抗原(PPE25和PE19多肽較弱)刺激產(chǎn)生了較高水平IFN-γ+T細(xì)胞應(yīng)答,均顯著高于CS-pHSP65和對(duì)照組(p0.05)；還對(duì)BCG缺失的ESAT-61-20有良好反應(yīng),提示CS-pPES滴鼻免疫誘導(dǎo)了肺臟黏膜局部多抗原特異性IFN-γ+T細(xì)胞應(yīng)答,但略低于BCG效果。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：CS-pPES免疫小鼠肺單核細(xì)胞誘導(dǎo)了結(jié)核特異性分泌3種細(xì)胞因子的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答,總體水平顯著高于BCG、及對(duì)照和CS-pHSP65載體組(p0.05)。提示CS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫可顯著誘導(dǎo)肺臟黏膜局部CD4+和CD8+多功能T細(xì)胞應(yīng)答,且該應(yīng)答顯著高于陽(yáng)性對(duì)照BCG。4、CS-pPES疫苗滴鼻免疫的抗結(jié)核免疫保護(hù)大劑量BCG滴鼻攻毒后4周,肺臟病理結(jié)果顯示,BCG皮下免疫組顯示了最好的免疫保護(hù)效果；而CS-PES滴鼻免疫組肺臟病理顯著優(yōu)于CS-pHSP65疫苗組和對(duì)照,雖仍有肺泡細(xì)胞壁增厚和少量炎癥。攻毒后肺、脾細(xì)菌數(shù)由105.8、105.1顯著降低為104.6、104.4,提示CS-pPES結(jié)核黏膜疫苗滴鼻免疫能部分保護(hù)小鼠,但總體效果低于BCG疫苗。綜上,我們構(gòu)建的含有5個(gè)結(jié)核T細(xì)胞表位的pPES多表位核酸疫苗,經(jīng)chitosan組裝后,經(jīng)滴鼻免疫,顯著增強(qiáng)了裸露DNA所不能誘導(dǎo)的肺灌洗液SIgA和肺臟IFN-γ+、IL-2+、TNF-α+T細(xì)胞應(yīng)答,但在脾臟T細(xì)胞免疫強(qiáng)度和攻毒炎癥保護(hù)方面效果略低于BCG疫苗。有待進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)這一黏膜疫苗。第三部分甘露糖化殼聚糖增強(qiáng)DNA疫苗的黏膜免疫與保護(hù)效果為進(jìn)一步增強(qiáng)結(jié)核特異性黏膜免疫,我們將黏膜遞送載體殼聚糖進(jìn)行甘露糖化修飾,而后與質(zhì)粒DNA通過(guò)共凝聚法形成MCS-pPES復(fù)合物顆粒疫苗,研究其理化特性并在小鼠體內(nèi)的檢測(cè)其免疫原性和免疫保護(hù)特性。1、CS-DNA和MCS-DNA復(fù)合物的理化特性研究以殼聚糖(CS)及甘露糖化殼聚糖(MCS)溶液,分別與質(zhì)粒pPES復(fù)合形成CS-DNA和MCS-DNA復(fù)合物顆粒。經(jīng)掃描電鏡證實(shí)復(fù)合物為均一的球形顆粒,MCS-DNA顆粒約250-400nm,略大于CS-DNA。CS和MCS包裝DNA效率將近100%,并可有效保護(hù)DNA免受DNA酶的降解。2、MC-pPES疫苗滴鼻免疫誘生的特異性抗體免疫應(yīng)答以MCS-pPES、CS-pPES、pPES、MC-vector、CS-vector結(jié)核黏膜基因疫苗于0、2、4、6周滴鼻免疫小鼠,每次50μg,共4次,BCG皮下注射為陽(yáng)性對(duì)照。MCS-DNA誘導(dǎo)的血清IgG效價(jià)近1：4000,顯著高于DNA組,高于CS-DNA組(1：2800)。MCS-DNA免疫誘導(dǎo)的肺灌洗液SIgA效價(jià)為1：1100,顯著高于CS-DNA和BCG誘導(dǎo)SIgA(1：600,p0.05)；提示對(duì)黏膜遞送載體殼聚糖進(jìn)行甘露糖化修飾可顯著增強(qiáng)特異性黏膜抗體特別是SIgA應(yīng)答。3、MCS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的全身(脾臟)特異性T細(xì)胞免疫ELISPOT顯示,與CS-pPES相比,MCS-pPES滴鼻免疫顯著增強(qiáng)了各表位及結(jié)核抗原特異性IFN-γ+T應(yīng)答,且與BCG組相仿；同時(shí)對(duì)BCG缺失的ESAT-61-20抗原的應(yīng)答水平顯著高于BCG。流式細(xì)胞術(shù)顯示：MCS-pPES滴鼻免疫誘導(dǎo)的H37Rv特異性脾臟三細(xì)胞因子多功能T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)度(IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD8+T、TNF-α+CD4+T)均比CS-pPES疫苗效果顯著增強(qiáng),略低于BCG。5肽特異性脾臟多功能T應(yīng)答(IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T)在MCS-pPES均顯著性高于CS-pPES (p0.05) TNF-α,+T顯著高于BCG組(p0.05),提示MCS-pPES滴鼻免疫顯著增強(qiáng)H37Rv、5肽特異性脾臟多功能T細(xì)胞應(yīng)答。4、MCS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的肺黏膜局部特異性T細(xì)胞免疫ELISPOT顯示：MCS-pPES疫苗又顯著增強(qiáng)了CS-pPES及裸露DNA誘導(dǎo)的肺臟單核細(xì)胞IFN-γ+T應(yīng)答；且對(duì)5肽和HSP65蛋白的應(yīng)答均顯著高于BCG組(p0.05)流式細(xì)胞術(shù)顯示：MCS-pPES組誘導(dǎo)的H37Rv特異性肺臟多功能T應(yīng)答(IFN-γ+CD4+/CD8+T、TNF-α+CD4+T)均顯著高于CS-pPES組及對(duì)照組(p0.05),與BCG組近似。MC-pPES誘導(dǎo)的5肽特異性肺臟IFN-γ+CD4+/CD8+T、IL-2+CD4+T、 TNF-α+CD4+/CD8+T應(yīng)答均顯著高于CS-pPES,且高于BCG組(p0.05),提示甘露糖化殼聚糖組裝的pPES疫苗顯著增強(qiáng)5肽特異性肺黏膜多功能T細(xì)胞應(yīng)答,不僅優(yōu)于CS-pPES,且優(yōu)于BCG疫苗。5、抗結(jié)核免疫保護(hù)效果裸露DNA疫苗滴鼻免疫的保護(hù)效果有限：MCS-pPES黏膜疫苗的肺結(jié)核免疫保護(hù)效果與CS-pPES相比顯著增強(qiáng),肺臟炎癥浸潤(rùn)灶及炎癥程度顯著減少,肺臟細(xì)菌載量顯著降低,與BCG效果相仿。綜上,為提高殼聚糖遞送的多表位結(jié)合疫苗的免疫原性和免疫保護(hù),使用修飾的甘露糖化殼聚糖作為黏膜遞送載體,發(fā)現(xiàn)在特異性血清IgG、肺灌洗液SIgA、脾臟和肺臟IFN-γ+T細(xì)胞應(yīng)答均顯著高于殼聚糖疫苗效果,其中,肺灌洗液SIgA、肺臟單核細(xì)胞5肽特異性IFN-γ+T應(yīng)答、肺臟5肽特異性IFN-γ+CD4+/CD8+T、 IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T應(yīng)答均顯著高于CS-pPES及BCG組,提示誘導(dǎo)肺臟黏膜免疫的能力得以顯著提高。最終的免疫保護(hù)效果也得以顯著提高。第四部分甘露糖化殼聚糖特異靶向肺泡巨噬細(xì)胞的機(jī)制研究為了探討甘露糖化殼聚糖增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答的機(jī)制,我們通過(guò)幾種報(bào)告抗原的原位組織染色及免疫組化方法檢測(cè)了疫苗在肺臟的表達(dá)效率,并通過(guò)雙熒光共聚焦評(píng)估了兩種黏膜疫苗的肺泡靶向特性。1、原位組化檢測(cè)MCS-DNA的肺臟表達(dá)效率為了在體內(nèi)驗(yàn)證殼聚糖和甘露糖化殼聚糖對(duì)于DNA疫苗的遞送與表達(dá)效率,β-半乳糖苷酶為報(bào)告抗原：以含50ug質(zhì)粒DNA的CS-pLacZ及MCS-pLacZ滴鼻免疫小鼠。2天后取小鼠肺臟X-gal染色發(fā)現(xiàn)：裸露質(zhì)粒無(wú)法在肺臟有效表達(dá)；CS-p-LacZ質(zhì)粒在肺泡間質(zhì)有少量表達(dá)：而MCS-pLacZ滴鼻小鼠肺泡間質(zhì)及肺泡細(xì)胞內(nèi)LacZ的表達(dá)量和表達(dá)區(qū)域顯著高于其余兩組,提示殼聚糖與甘露糖化殼聚糖均可增強(qiáng)外源DNA在肺部的原位表達(dá),且甘露糖化殼聚糖增強(qiáng)抗原黏膜表達(dá)的能力最強(qiáng)。HSP65為報(bào)告抗原,48小時(shí)小鼠肺臟冰凍切片經(jīng)HSP65特異性抗體染色發(fā)現(xiàn)：CS-pHSP65顯著提高肺臟間質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)HSP65抗原表達(dá),而MCS-pHSP65的增強(qiáng)效果更為廣泛和強(qiáng)烈,提示殼聚糖和甘露糖化殼聚糖均可顯著增強(qiáng)DNA在肺部的原位表達(dá),以后者的增強(qiáng)效果更為顯著。2、FITC示蹤MCS-DNA的肺臟巨噬細(xì)胞靶向情況為了檢測(cè)甘露糖化殼聚糖是否可以有效靶向肺泡巨噬細(xì)胞,分別以FITC標(biāo)記殼聚糖和甘露糖化殼聚糖,而后以含50ugDNA的FITC-CS-DNA及FITC-MCS-DNA通過(guò)氣管灌注小鼠肺臟,取24小時(shí)肺臟冰凍切片,以抗小鼠單核+巨噬細(xì)胞抗體(MOMA-2)進(jìn)行特異染色,DAPI襯染,以共聚焦熒光顯微鏡觀察,結(jié)果顯示：小鼠肺泡巨噬細(xì)胞附近有一定的CS-DNA的熒光強(qiáng)度,而經(jīng)MCS-DNA免疫后,肺泡局部綠色熒光的數(shù)目和強(qiáng)度均有顯著提高,提示MCS-DNA比CS-DNA更能有效地到達(dá)肺泡巨噬細(xì)胞,即靶向性顯著增強(qiáng)。3、FITC示蹤MCS-DNA的巨噬細(xì)胞攝取能力為進(jìn)一步探究甘露糖化殼聚糖遞送系統(tǒng)指引下的肺泡巨噬細(xì)胞靶向后,對(duì)巨噬細(xì)胞的抗原攝取能力是否有影響,體外Raw264.7細(xì)胞,加入含2μg質(zhì)粒DNA的FITC標(biāo)記的CS-pPES及MCS-pPES,孵育0.5小時(shí)后共聚焦激光顯微鏡檢顯示：巨噬細(xì)胞細(xì)胞對(duì)于CS-pPES的攝取能力有限,而MCS-pPES對(duì)抗原的攝取能力顯著增強(qiáng),提示經(jīng)甘露糖修飾的殼聚糖遞送系統(tǒng)可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)疫苗復(fù)合物的攝取能力。綜上,我們創(chuàng)新性設(shè)計(jì)并構(gòu)建了多結(jié)核T表位嵌合的蛋白支架DNA疫苗pPES,并證實(shí)該表位嵌合構(gòu)建方式的免疫效果顯著優(yōu)于表位簡(jiǎn)單串聯(lián)、表位串聯(lián)后與HSP65串聯(lián)。為誘導(dǎo)結(jié)核特異性黏膜免疫,增強(qiáng)早期肺黏膜局部的SIgA(?)黏膜T細(xì)胞免疫,以殼聚糖作為黏膜遞送載體對(duì)多表位DNA疫苗予以組裝。CS-pPES疫苗經(jīng)滴鼻免疫,顯著增強(qiáng)了裸露DNA所不能誘導(dǎo)的肺灌洗液SIgA和肺單核細(xì)胞IFN-γ+T細(xì)胞應(yīng)答：而整體T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)度和抗結(jié)核保護(hù)效果仍低于BCG。為進(jìn)一步增強(qiáng)黏膜免疫,對(duì)殼聚糖進(jìn)行甘露糖化修飾而后制備MCS-pPES黏膜結(jié)核疫苗。證實(shí)其滴鼻免疫誘導(dǎo)的各項(xiàng)全身免疫和黏膜免疫顯著高于CS-pPES疫苗：不僅如此,在肺灌洗液SIgA、肺臟單核細(xì)胞5肽特異性IFN-γ+T應(yīng)答、IL-2+CD4+T、TNF-α+CD4+/CD8+T應(yīng)答均顯著高于BCG組,提示誘導(dǎo)肺臟黏膜免疫的能力得以顯著提高。最終的免疫保護(hù)效果也得以顯著提高。經(jīng)體外機(jī)制的探討,證實(shí)對(duì)遞送載體甘露糖化的設(shè)計(jì)的確顯著增強(qiáng)了肺泡巨噬細(xì)胞靶向、肺泡抗原表達(dá)和巨噬細(xì)胞攝取。這一黏膜靶向性載體(佐劑)設(shè)計(jì)策略兼顧了黏膜靶向和黏膜APC功能增強(qiáng)功能,預(yù)期在增加我們的結(jié)核疫苗的表位種類(lèi)和組合基礎(chǔ)上(目前僅5個(gè)表位,偏少),可實(shí)現(xiàn)更為有效可觀的結(jié)核疫苗保護(hù)效果。本研究為多表位結(jié)核疫苗的分子設(shè)計(jì)及新型結(jié)核黏膜疫苗設(shè)計(jì)提供了新思路,為肺結(jié)核的免疫保護(hù)機(jī)制提供了有關(guān)肺臟黏膜SIgA和黏膜T細(xì)胞應(yīng)答的有益補(bǔ)充。制備的兩種結(jié)核黏膜疫苗在進(jìn)一步增加優(yōu)勢(shì)抗原表位組合基礎(chǔ)上,有望獲得更為高效的黏膜免疫與結(jié)核保護(hù)效果。
【關(guān)鍵詞】：肺結(jié)核 黏膜免疫 SIgA 多表位核酸疫苗 肺靶向
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-14
• Abstract14-29
• 前言29-38
• 1. 結(jié)核病現(xiàn)狀與結(jié)核疫苗研制現(xiàn)狀29-30
• 2. 抗結(jié)核免疫保護(hù)機(jī)制30-32
• 3. 黏膜局部免疫對(duì)于抗結(jié)核免疫保護(hù)的作用32-33
• 4. 本課題的新型結(jié)核疫苗設(shè)計(jì)理念：多表位蛋白支架疫苗33-36
• 5. 黏膜遞送載體36-38
• 第一部分 多表位DNA疫苗的設(shè)計(jì)、構(gòu)建、表達(dá)與免疫原性鑒定38-59
• 1. 引言38-40
• 2. 材料與方法40-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料40-41
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法41-47
• 3. 結(jié)果47-57
• 3.1 以HSP65為骨架的嵌合多表位核酸疫苗PES的分子設(shè)計(jì)47-50
• 3.2 真核質(zhì)粒pPES、pHSP65、p5pep、pHSP65-pep的構(gòu)建和鑒定50-52
• 3.3 重組HSP65蛋白的原核表達(dá)純化52-53
• 3.4 pPES質(zhì)粒的體外真核表達(dá)53-54
• 3.5 pPES疫苗的免疫原性及嵌合蛋白載體表達(dá)的優(yōu)越性54-57
• 4. 討論57-59
• 第二部分 脫乙酰殼聚糖組裝的結(jié)核DNA疫苗誘導(dǎo)的黏膜免疫與保護(hù)效果59-74
• 1. 引言59-60
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料與方法60-63
• 2.1 試驗(yàn)材料60-61
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法61-63
• 3. 結(jié)果63-72
• 3.1 chitosan-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答63-64
• 3.2 CS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的特異性全身(脾臟)細(xì)胞免疫64-67
• 3.3 CS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的特異性肺局部黏膜細(xì)胞免疫67-70
• 3.4 CS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的抗結(jié)核免疫保護(hù)70-72
• 4. 討論72-74
• 第三部分 甘露糖化殼聚糖增強(qiáng)DNA疫苗的黏膜免疫與保護(hù)效果74-96
• 1. 引言74-75
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料和方法75-76
• 2.1 試劑材料75
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法75-76
• 3. 結(jié)果76-94
• 3.1 CS-DNA和MCS-DNA復(fù)合物的理化特性76-78
• 3.2 MCS-pPES疫苗滴鼻免疫誘生的特異性抗體免疫應(yīng)答78-80
• 3.3 MCS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的全身(脾臟)特異性T細(xì)胞免疫80-86
• 3.4 MCS-pPES疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的肺黏膜局部特異性T細(xì)胞免疫86-92
• 3.5 MCS-pPES黏膜疫苗滴鼻免疫誘導(dǎo)的免疫保護(hù)92-94
• 4. 討論94-96
• 第四部分 MCS-PPES增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答的機(jī)制探討96-103
• 1. 引言96-97
• 2. 試驗(yàn)材料與方法97-98
• 2.1 試驗(yàn)材料97
• 2.2. 實(shí)驗(yàn)方法97-98
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果98-101
• 3.1 β-半乳糖苷酶為報(bào)告抗原原位組化檢測(cè)MCS-DNA的肺臟表達(dá)效率98-99
• 3.2. HSP65為報(bào)告抗原原位免疫組化檢測(cè)MCS-DNA的肺臟表達(dá)效率99-100
• 3.3 以FITC示蹤MCS-DNA的肺臟巨噬細(xì)胞靶向情況100
• 3.4 以FITC示蹤MCS-DNA的巨噬細(xì)胞攝取能力100-101
• 4. 討論101-103
• 小結(jié)103-105
• 參考文獻(xiàn)105-111
• 綜述111-126
• 參考文獻(xiàn)117-126
• 附錄126-127
• 縮寫(xiě)詞表127-128
• 致謝128

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉成芳;殷國(guó)榮;趙瑞君;孔麗;;弓形蟲(chóng)復(fù)合疫苗滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)腸淋巴細(xì)胞變化[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2012年01期

2 黃建,王菱章,李君賢,林增良;布氏活菌苗人體滴鼻免疫的效果[J];中國(guó)地方病學(xué)雜志;1983年01期

3 舒翠莉,彭虹,王華,陳潔,高杰英;滴鼻免疫有效的誘導(dǎo)粘膜及系統(tǒng)免疫反應(yīng)[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2001年04期

4 舒翠莉,高杰英,彭虹,王華,陳潔,石辛甫,邢麗;雙價(jià)痢疾疫苗滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)持續(xù)性粘膜與系統(tǒng)免疫反應(yīng)[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2002年05期

5 石辛甫,邢麗,彭虹,高杰英;不同表型雙價(jià)痢疾菌苗滴鼻免疫小鼠后黏膜和系統(tǒng)記憶反應(yīng)觀測(cè)[J];免疫學(xué)雜志;2002年06期

6 關(guān)麗;張鐵娥;王海龍;孟曉麗;楊建一;殷國(guó)榮;;重組弓形蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白解聚因子滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答及保護(hù)作用[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2014年02期

7 舒翠莉,高杰英,彭虹,王華,陳潔,石辛甫;雙價(jià)志賀疫苗滴鼻免疫小鼠后粘膜免疫與系統(tǒng)免疫應(yīng)答持續(xù)時(shí)間的觀察[J];上海免疫學(xué)雜志;2002年04期

8 劉吏婷;江海燕;顏艷;崔平;王希良;王建華;;以霍亂毒素重組B亞單位為佐劑的流感抗原滴鼻免疫效果研究[J];西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào);2007年04期

9 孟曉麗;殷國(guó)榮;劉紅麗;石蓉;張宇斌;馬秀瑞;;不同劑量STAg滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的抗弓形蟲(chóng)感染作用[J];中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào);2006年03期

10 孟曉麗;殷國(guó)榮;張建紅;劉紅麗;申金雁;李珀;;弓形蟲(chóng)復(fù)合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的Peyer's patches持續(xù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答[J];中國(guó)病原生物學(xué)雜志;2008年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前7條

1 楊曉紅;趙華明;湯兆強(qiáng);范雪梅;宋麗云;殷國(guó)榮;張志華;段希玲;;肌幼蟲(chóng)可溶性抗原滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的抗旋毛蟲(chóng)感染作用[A];全國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

2 孟曉麗;殷國(guó)榮;楊亞波;張杰;唐旭;吳靜;馬廣源;;弓形蟲(chóng)復(fù)合黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的特異性抗體持續(xù)時(shí)間觀察[A];全國(guó)人畜共患病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

3 弓鴻飛;劉紅麗;孟曉麗;劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn);殷國(guó)榮;;弓形蟲(chóng)可溶性速殖子抗原聯(lián)合IFN-γ佐劑滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答動(dòng)態(tài)觀察[A];全國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

4 劉紅麗;孟曉麗;弓鴻飛;殷國(guó)榮;;弓形蟲(chóng)STAg聯(lián)合IFN-γ佐劑滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)不同黏膜部位抗體水平動(dòng)態(tài)觀察[A];全國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

5 石蓉;孟曉麗;武云香;劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn);殷國(guó)榮;;CpG ODN聯(lián)合STAg滴鼻免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答動(dòng)態(tài)觀察[A];全國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

6 石蓉;殷國(guó)榮;孟曉麗;劉紅麗;張杰;;CpG ODN聯(lián)合STAg滴鼻免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)熱帶病與寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)機(jī)會(huì)性感染學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2007年

7 劉紅麗;殷國(guó)榮;馬曉明;管志玉;韓惠瑛;;ESA聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的弓形蟲(chóng)特異性免疫應(yīng)答[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)熱帶病與寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)機(jī)會(huì)性感染學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2007年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 吳曼麗;一種肺泡巨噬細(xì)胞靶向的多表位結(jié)核粘膜疫苗[D];蘇州大學(xué);2015年

2 孟曉麗;STAg和霍亂毒素滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的弓形蟲(chóng)特異性黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答[D];山西醫(yī)科大學(xué);2005年

3 黨威;小鼠FcRn介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)禽流感抗原的粘膜免疫研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

4 郝海霞;剛地弓形蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白基因的克隆、表達(dá)及重組蛋白的保護(hù)性免疫[D];山西醫(yī)科大學(xué);2012年

5 管志玉;ESA聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的弓形蟲(chóng)特異性黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

6 弓鴻飛;STAg聯(lián)合IFN-γ佐劑滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的弓形蟲(chóng)特異性黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

7 石蓉;CpG寡核苷酸和霍亂毒素聯(lián)合STAg滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的弓形蟲(chóng)特異性免疫應(yīng)答[D];山西醫(yī)科大學(xué);2006年

8 唐旭;STAg聯(lián)合ESA滴鼻免疫小鼠對(duì)弓形蟲(chóng)垂直傳播的阻斷作用[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

9 劉吏婷;流感黏膜疫苗的初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

10 李珀;CT聯(lián)合ESA鼻內(nèi)免疫小鼠誘導(dǎo)的抗弓形蟲(chóng)感染保護(hù)性免疫應(yīng)答[D];山西醫(yī)科大學(xué);2010年

  本文關(guān)鍵詞：一種肺泡巨噬細(xì)胞靶向的多表位結(jié)核粘膜疫苗，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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