【摘要】：結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原體。其導(dǎo)致的較高的發(fā)病率和致死率,目前仍是很多發(fā)展中國家需要面臨的一個重大的亟待解決的健康問題。2012年據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計,全球約有130萬人死于結(jié)核病。我國活動性肺結(jié)核人數(shù)高居世界第二位,是結(jié)核病高負擔(dān)國家。近年來,伴隨著多重耐藥結(jié)核桿菌(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的出現(xiàn),以及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染與TB聯(lián)合發(fā)病,結(jié)核病的疫情在發(fā)展中國家一直呈上升的趨勢,非結(jié)核分枝桿菌病也呈逐漸增加趨勢。早期以及明確的診斷對治療、預(yù)后有著極其重要的意義。目前臨床上應(yīng)用的結(jié)核病診斷技術(shù)主要有結(jié)核菌素(PPD)試驗、痰細菌培養(yǎng)、抗酸染色、PCR、血清學(xué)抗體檢測、IFN-y的T-Spot檢測及基因芯片等方法,而這些診斷方法在臨床應(yīng)用中均存在或多或少的局限性,如PPD試驗的假陽性率高,無法區(qū)分是感染還是卡介苗-BCG接種；而T-Spot及基因芯片操作繁瑣成本較局；ELISpot或T-Spot不能檢測T細胞免疫缺陷的感染者；抗體的檢測無法診斷感染早期抗原出現(xiàn)然而抗體還未產(chǎn)生的“窗口期”；PCR無法區(qū)分結(jié)核桿菌的活動狀態(tài),并且需要成本高的試劑和儀器,不能區(qū)分感染樣品中的活菌和死菌；痰培養(yǎng)的方法周期長、易污染；抗酸染色的方法靈敏度低,檢出率低。因此,亟待開發(fā)新型的、有效的結(jié)核診斷試劑,特別是早期抗原診斷和肺外結(jié)核診斷試劑的開發(fā)具有重要意義。 我們選定中國主要流行株結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株作為篩選毒性結(jié)核分支桿菌特異性分子標記物的實驗?zāi)Ｐ?以甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖作為搜尋的主要診斷分子標記。結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株是亞洲廣泛流行的結(jié)核致病菌,是1995年人們利用Spoligotyping技術(shù)對中國北京地區(qū)的結(jié)核分枝桿菌進行基因分型,發(fā)現(xiàn)了具有顯著相似遺傳特征的結(jié)核分枝桿菌菌株群。結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株其較H37Rv菌株有更強的毒力、更廣泛的傳播性以及耐藥性。尤其是在中國,結(jié)核分枝桿菌北京基因型菌株在流行菌株中占絕對優(yōu)勢,因而適于作為本研究的實驗?zāi)Ｐ汀８事短切揎椀闹⒗事毒厶?Mannosylated lipoarabinomannan, ManLAM)是普遍存在于毒性分枝桿菌表面的一種較為豐富的脂糖。像許多毒性結(jié)核分支桿菌一樣,北京基因型菌株表面也存在著ManLAM脂糖。ManLAM其在不同的結(jié)核分枝桿菌中結(jié)構(gòu)各異,并且在結(jié)核分枝桿菌感染宿主細胞的過程中主要發(fā)揮免疫抑制作用。ManLAM脂糖隨著菌體侵入宿主細胞在細胞內(nèi)部分裂增殖以及與宿主細胞相互作用的過程中脫落并釋放入感染部位并進入血循環(huán)。由于ManLAM在不同的毒性結(jié)核分枝桿菌的結(jié)構(gòu)差異,以及其在感染過程中可脫落進入血循環(huán),因而極適于作為診斷分子標記。因此本研究針對北京基因型菌株特異的ManLAM脂糖,篩選出能與之特異性結(jié)合的具有抗體特性的適配子(aptamer),從而實現(xiàn)通過對臨床結(jié)核病體液標本中ManLAM脂糖的檢測達到結(jié)核脂糖抗原早期診斷目的。 鑒于ManLAM脂糖的免疫原性較弱,其抗體的制備較為困難,因此本研究利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選獲得了針對北京基因型結(jié)核分枝桿菌表面脂糖ManLAM的單鏈DNA適配子“抗體”T9,其對北京基因型菌株ManLAM脂糖具有高親和力(Kd=685±131nM)和高特異性。通過對收集得到的臨床活動性結(jié)核病人痰液標本及血清標本進行檢測,適配子T9可以有效診斷結(jié)核病,同時采用適配子T9在對病人痰液的檢測與金胺O染色法檢測陽性標本的結(jié)果相關(guān)性較高(r2=0.8062),對活動結(jié)核病人血清的檢測其診斷特異性和靈敏度分別為77.45%和92.65%,顯示出了較高的診斷水平；同時采用適配子T9對肺外結(jié)核血標本進行檢測,也能夠有效地診斷肺外結(jié)核病,其診斷特異性和靈敏性分別為94.12%和90.32%,從而為臨床診斷提供新策略。研究過程中,我們意外發(fā)現(xiàn),6名確診結(jié)核病的嬰幼兒和兒童(6個月-8歲)患者在T-Spot檢查中顯示為陰性,而在本研究的ELONA (T9)檢測結(jié)果顯示,其全部為陽性。因此推測,通過對臨床血標本中ManLAM脂糖抗原的檢測,能夠較T-Spot法提高對嬰幼兒和兒童的感染結(jié)核分枝桿菌的檢出率。 鑒于蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的翻譯后修飾,參與各種生命活動過程,如細胞增殖、細胞凋亡、腫瘤遷徙、免疫保護等。而不同種類的凝集素具有特異性的結(jié)合不同的糖苷的特性,因此為探討結(jié)核分枝桿菌感染對宿主的糖蛋白糖苷的影響,本次研究利用這一特性建立的高通量的凝集素芯片技術(shù),從而對結(jié)核分枝桿菌感染引起宿主的糖蛋白和糖苷的改變進行了檢測。采用凝集素芯片開展以下兩方面工作： (1)對結(jié)核分枝桿菌標準株H37Rv毒性菌株和H37Ra弱毒分枝桿菌分別感染小鼠腹腔巨噬細胞后細胞膜糖蛋白和糖苷的差異表達進行檢測,篩選出差異較大的凝集素ABA,其特異性結(jié)合的糖蛋白在H37Rv感染的小鼠腹腔巨噬細胞表面感染前后顯著增高,而在H37Ra感染的小鼠腹腔巨噬細胞表面感染前后無明顯變化；。進一步在體外驗證了凝集素ABA能夠明顯抑制小鼠腹腔巨噬細胞吞噬H37Rv,說明結(jié)核感染后的細胞表面凝集素ABA特異結(jié)合的糖蛋白增高,ABA可以阻斷細菌的感染；進一步在結(jié)核病人中驗證,發(fā)現(xiàn)凝集素ABA與結(jié)核患者PBMC細胞膜表面結(jié)合力也遠高于健康人的。通過質(zhì)譜技術(shù)對凝集素ABA結(jié)合的巨噬細胞膜糖蛋白鑒定,在檢測的蛋白中篩選出CD44和Glectin-9作為候選差異分子。(2)使用凝集素芯片技術(shù)檢測活動性結(jié)核病人與健康人血清中差異表達的糖蛋白和糖苷,結(jié)果顯示凝集素EBL、MAL-I、ABA結(jié)合的糖苷較健康人的顯著上升,并且通過免疫印跡(Western Blot)驗證發(fā)現(xiàn)了差異表達的蛋白條帶。隨后,對凝集素ABA鑒定的結(jié)核病患者血清中差異表達的糖蛋白,取分子量介于10kD-15kD區(qū)域進行質(zhì)譜鑒定,并在諸多種類的蛋白質(zhì)中篩選出血小板4因子作為候選差異分子可能可以作為診斷分子標志物之一。 綜上所述,首先我們運用SELEX篩選技術(shù)成功地篩選獲得了高親和力、高特異性結(jié)合北京基因型結(jié)核分枝桿菌表面脂糖ManLAM的ssDNA適配子T9,并建立ELONA檢測方法對結(jié)核病血清以及痰液進行檢測,該研究成果為結(jié)核特異脂糖抗原的早期診斷提供了新的策略；我們還采用凝集素芯片技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致宿主糖蛋白和糖苷的差異表達進行了篩選,篩選出的差異表達的糖蛋白和糖苷,包括凝集素ABA特異結(jié)合的巨噬細胞和PBMC表面的糖蛋白如CD44和Glectin-9、和結(jié)核患者血清中的糖蛋白如血小板4因子,這些糖蛋白和其糖苷將可能為結(jié)核病特異診療提供新的診斷標志物。
【圖文】：

銀染結(jié)果顯示初糖中主要存在兩種成分，，其主要成分ManLAM脂糖分子量約集中在34kD至26kD之間，LAM分子量約集中在26 kD至17kD之間（圖1A);隨后的糖原染色鑒定，其主要成為仍為兩種多糖類物質(zhì)，其分子量分布與確酸銀染色分布一致（圖IB);經(jīng)過純化之后的ManLAM脂糖經(jīng)x核嵋舊笤

本文編號：2683596