【摘要】：腸道菌群對(duì)維持宿主的健康有重要作用,它不僅與一些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),還影響宿主的衰老過程。在利用一些簡(jiǎn)單的模式生物如果蠅和線蟲的研究中,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌突變株決定了宿主的壽命,且某些細(xì)菌分泌的一些小分子物質(zhì)與宿主的長(zhǎng)壽相關(guān)。然而,在具有復(fù)雜的腸道共生菌群的哺乳動(dòng)物中,發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)或者延緩衰老及其相關(guān)疾病發(fā)生的腸道菌群成員并闡明其作用機(jī)制,仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。不造成營(yíng)養(yǎng)不良的節(jié)食的抗炎與延長(zhǎng)壽命的作用已在多種動(dòng)物模型中得到證實(shí),而在前期研究中發(fā)現(xiàn),全生命周期的節(jié)食能夠引起小鼠腸道菌群發(fā)生顯著變化,尤其是增加小鼠腸道中有益菌Lactobacillus的含量,且節(jié)食塑造的腸道菌群與小鼠壽命及中年時(shí)期的代謝健康顯著相關(guān)。因此,節(jié)食塑造的腸道菌群及其中的關(guān)鍵細(xì)菌類群在節(jié)食發(fā)揮抗炎與延長(zhǎng)壽命作用中的功能值得進(jìn)一步探究。首先,為了進(jìn)一步解析腸道菌群對(duì)節(jié)食處理的響應(yīng)情況,我們以雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠為模型,設(shè)立節(jié)食組(減少30%進(jìn)食量,CR)和自由進(jìn)食組(NC),進(jìn)行為期84天的實(shí)驗(yàn),分析短期節(jié)食處理對(duì)小鼠代謝表型的影響,并利用高通量測(cè)序的方法監(jiān)測(cè)節(jié)食處理過程中小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示84天的節(jié)食處理能夠顯著改善小鼠的代謝表型,包括葡萄糖-胰島素穩(wěn)態(tài)增強(qiáng)、血清炎性相關(guān)因子瘦素水平降低、抗炎性脂肪因子脂聯(lián)素的分泌增加。節(jié)食處理2周使小鼠腸道中建立起一種Lactobacillus占優(yōu)勢(shì)的腸道菌群結(jié)構(gòu),并顯著降低小鼠血液中脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein,LBP;指征宿主循環(huán)系統(tǒng)中由腸道菌群產(chǎn)生的抗原總量)和系統(tǒng)性炎癥因子TNF-α的水平。對(duì)50個(gè)響應(yīng)節(jié)食處理的關(guān)鍵操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)進(jìn)行共變化網(wǎng)絡(luò)分析顯示,節(jié)食小鼠腸道中豐度最高的Lactobacillus OTU與受CR抑制的大多數(shù)關(guān)鍵OTU呈顯著負(fù)相關(guān)。節(jié)食處理在小鼠腸道中快速建立起Lactobacillus占優(yōu)勢(shì)的腸道菌群結(jié)構(gòu),并顯著降低小鼠的系統(tǒng)性炎癥水平,但優(yōu)勢(shì)Lactobacillus是否作為節(jié)食塑造的腸道菌群中的關(guān)鍵功能菌來發(fā)揮健康作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。然后,我們采用“序列引導(dǎo)”的方法從節(jié)食處理約2周的小鼠糞便樣品中分離出兩株代表腸道中優(yōu)勢(shì)乳桿菌的菌株,并通過全基因組測(cè)序?qū)@兩株乳桿菌進(jìn)行鑒定和比較分析。根據(jù)兩株乳桿菌分離物與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有Lactobacillus murinus基因組間平均核苷酸相似性(average nucleotide identity,ANI)大于96%,將其鑒定為L(zhǎng).murinus,命名為L(zhǎng).murinus CR141和L.murinus CR147。全基因組比較分析結(jié)果顯示,兩株L.murinus全基因組序列組成高度相似,但長(zhǎng)約1.6 Mb的片段在兩基因組間互為倒位,且CR141和CR147分別含有40和46個(gè)菌株特異性蛋白編碼序列(coding sequences,CDS)。作為節(jié)食小鼠腸道中占優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類群,這兩株基因組序列高度相似的L.murinus菌株的功能需要進(jìn)一步深入研究。我們利用多種研究模型分析了這兩株在節(jié)食小鼠腸道中顯著富集的L.murinus的功能。在TNF-α誘導(dǎo)的炎癥Caco-2細(xì)胞模型中,添加10%的L.murinus CR147菌株的發(fā)酵液上清顯著下調(diào)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-8的分泌水平。在秀麗隱桿線蟲模型中,我們將L.murinus與線蟲標(biāo)準(zhǔn)飲食Escherichia coli OP50混合飼喂線蟲,發(fā)現(xiàn)以1:9比例混合E.coli OP50與L.murinus CR147顯著延長(zhǎng)線蟲的壽命并增加線蟲的產(chǎn)卵量。與L.murinus CR147菌株相比,L.murinus CR141菌株在細(xì)胞和線蟲模型中均未顯示類似的功能。之后我們將18月齡SPF級(jí)小鼠的糞便菌群移植到10月齡無菌小鼠中,發(fā)現(xiàn)添加L.murinus CR147能夠顯著改善衰老菌群造成的小鼠腸屏障破壞,從而減少小鼠血液中LBP含量并降低小鼠血液中TNF-α的水平。以上研究結(jié)果表明,L.murinus CR147可能作為節(jié)食塑造的腸道菌群中的關(guān)鍵有益細(xì)菌而對(duì)節(jié)食發(fā)揮抗炎與延長(zhǎng)壽命的作用有重要貢獻(xiàn)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)從節(jié)食小鼠糞便樣品中分離的優(yōu)勢(shì)L.murinus菌株是節(jié)食塑造的腸道菌群中對(duì)節(jié)食產(chǎn)生的健康效應(yīng)有重要貢獻(xiàn)的細(xì)菌。本研究對(duì)于人類抗衰老研究有重要貢獻(xiàn),提示我們通過選擇性富集腸道中的關(guān)鍵有益菌能夠作為改善腸屏障、減輕系統(tǒng)性炎癥并延長(zhǎng)壽命的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1-1 線蟲成蟲蟲體解剖結(jié)構(gòu)示意圖（圖片來源于 WormAtlas）（A）雌雄同體線蟲。（B）雄性線蟲。igure 1-1. The dissection of adult C. elegans (Figure is from WormAtlas). (A) Hermaphrodite.Male. Scale bar 0.1 mm.C. elegans 有雄性和雌雄同體兩種性別，，均為含 5 對(duì)常染色體的二倍體，其中雌雄同體有兩條 X 染色體（XX），而雄性線蟲只有一條 X 染色體（XO）。雌雄同體線蟲有 2 個(gè)卵巢個(gè)輸卵管、2 個(gè)受精囊（Spermatheca）及單一子宮（Uterus）（圖 1-1A）。雄性線蟲有 1 個(gè)性腺（Gonad）、輸精管（Vasdeferens）及 1 個(gè)高度特化為交配用的尾部（Tail），該特化部使得雄性線蟲在顯微鏡下極易識(shí)別（圖 1-1B）。雌雄同體線蟲能夠同時(shí)產(chǎn)生精子和卵母，可進(jìn)行自體受精或與雄性線蟲交配，但不能與其它雌雄同體線蟲交配。雄性線蟲只能精子，需與雌雄同體線蟲交配才能繁殖。雌雄同體線蟲自體受精可產(chǎn)生大約 300 個(gè)后代多數(shù)為雌雄同體線蟲，僅約 0.1%的后代為雄性線蟲。當(dāng)雌雄同體線蟲與雄性線蟲交配者產(chǎn)生的精子競(jìng)爭(zhēng)性地同雌雄同體線蟲產(chǎn)生的卵母細(xì)胞結(jié)合，可產(chǎn)生 1000 多個(gè)卵，其中與雌雄同體后代各占一半。雌雄同體線蟲自體受精使得純合體母蟲繁殖一群遺傳背景完同的后代，而雌雄同體與雄性線蟲交配有助于突變體的獲得與保持、并實(shí)現(xiàn)突變性狀在間的轉(zhuǎn)移，C.elegans 這種特殊的生殖方式使得其成為遺傳學(xué)研究的重要模式生物。本研使用的均為雌雄同體線蟲。C. elegans 的基本生命周期[116]如圖 1-2 所示。在適宜的培養(yǎng)條件下，雌雄同體線蟲產(chǎn)生

圖 1-2. C. elegans 在 22 °C 時(shí)的生命周期（圖片來源于 WormAtlas）。Figure 1-2. Life cycle of C. elegans at 22°C (Figure from WormAtlas).C. elegans 全基因組測(cè)序已于 1998 年完成，是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的多細(xì)胞真核生物，其基因組大小為 100 Mb（C. elegans Sequencing Consortium，1998）[120]，含有 20219 個(gè)蛋白編碼基因（WormBase 版本 WS61）。研究顯示，C.elegans 中至少 38%的蛋白編碼基因在人類基因組中具有同源基因[121]，而人類基因組中 60-80%的蛋白編碼基因在線蟲基因組中存在同源基因[122]，已知的人類疾病相關(guān)基因中的 40%在線蟲基因組中存在同源基因[123, 124]。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R-332;R33

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