【摘要】：容積調(diào)控氯通道(volume regulated chloride channel,VRCC),也被稱(chēng)為體積敏感外向整流陰離子通道(volume-sensitive outwardly rectifying anion channel,VSOR),是氯離子通道大家族中的一員,因其能被細(xì)胞體積變化所激活,產(chǎn)生具有外向整流特點(diǎn)的氯離子電流而被命名為VRCC。VRCC表達(dá)分布廣泛,存在于幾乎所有脊椎動(dòng)物細(xì)胞,自上世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)以來(lái),眾多實(shí)驗(yàn)證明VRCC在細(xì)胞容積的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的增殖分化和凋亡、腫瘤耐藥性的形成、腦缺血神經(jīng)毒性損傷、胰島素抵抗等生理、病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。2014年,兩個(gè)小組獨(dú)立同時(shí)報(bào)道了LRRC8(leucine-rich repeat-containing 8)家族蛋白是構(gòu)成VRCC的分子基礎(chǔ),此外,Bestrophin及TMEM16A(Anoctamins-1)也被認(rèn)為可能參與VRCC的構(gòu)成。LRRC8家族蛋白作為構(gòu)成VRCC的主要分子基礎(chǔ),其一共有5個(gè)成員:LRRC8A-E,這些成員的不同組合構(gòu)成不同類(lèi)型VRCC,其中LRRC8A可能構(gòu)成VRCC的孔區(qū)。VRCC受細(xì)胞腫脹的激活機(jī)制尚不清楚。前期研究表明細(xì)胞內(nèi)微域Ca~(2+)和細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)在VRCC的激活中占有重要地位,所以本課題將主要以此為切入點(diǎn)進(jìn)行研究,致力于利用超高分辨率顯微鏡STORM技術(shù)在分子水平上分析激活VRCC的局部微環(huán)境的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy,STORM)和結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(Structured Illumination Microscopy,SIM)是近年來(lái)發(fā)明的眾多超高分辨率顯微鏡技術(shù)中的兩種。STORM利用一種光學(xué)可切換的熒光分子來(lái)實(shí)現(xiàn)高精度定位,它的分辨率在理論上可達(dá)到10-20 nm,10倍于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率。SIM利用高頻條紋照明所產(chǎn)生的莫爾紋,將樣品的高頻信號(hào)與低頻信號(hào)分開(kāi),從而看清楚細(xì)胞的超細(xì)結(jié)構(gòu),它的分辨率理論上可以達(dá)到100 nm左右,并且由于SIM的時(shí)間分辨率非常高,可達(dá)到0.6秒/幀,所以可以進(jìn)行活細(xì)胞水平的超高分辨率成像。Kv7/KCNQ鉀離子通道家族含有5個(gè)成員,KCNQ1-5,其中KCNQ2和KCNQ3在生理狀態(tài)下可以形成異源四聚體,而KCNQ2和KCNQ4則不能形成。最近利用STORM技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了區(qū)分KCNQ2-4之間不同超微結(jié)構(gòu)的相互作用。利用這一新的發(fā)展,在第一部分研究中我們利用KCNQ分子間相互作用為模板,建立了利用STORM超高分辨技術(shù)分析分子間相互作用的超高分辨率實(shí)驗(yàn)平臺(tái)以及數(shù)據(jù)分析方法。利用此實(shí)驗(yàn)平臺(tái),我們?cè)诘诙糠种饕肧TORM技術(shù)分析了LRRC8家族蛋白質(zhì)亞基的共定位以及LRRC8A與參與細(xì)胞膜微域結(jié)構(gòu)和Ca~(2+)動(dòng)力學(xué)的重要的蛋白質(zhì)如ANO1、IP3R和小窩蛋白之間的相互作用。第一部分超高分辨率顯微鏡實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和數(shù)據(jù)分析方法的建立目的:建立穩(wěn)定可靠的STORM和SIM實(shí)驗(yàn)平臺(tái)以及數(shù)據(jù)分析方法。方法:(1)在HEK293A細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染總量為300 ng的KCNQ2+KCNQ3以及KCNQ2+KCNQ4 cNDA。(2)進(jìn)行SORM相關(guān)染色處理,并進(jìn)行STORM成像。(3)利用OriginPro8和Metlab等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。(4)分離培養(yǎng)大鼠DRG神經(jīng)元,進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色,標(biāo)記Tubulin,然后進(jìn)行SIM成像。(5)用攜帶熒光蛋白的病毒對(duì)野生型HEK293A的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜進(jìn)行特異性標(biāo)記,然后結(jié)合細(xì)胞微灌流系統(tǒng)進(jìn)行SIM活細(xì)胞成像,觀察細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果:(1)在STORM成像下,KCNQ2和KCNQ3呈現(xiàn)明顯共定位,但是KCNQ2和KCNQ4沒(méi)有出現(xiàn)共定位。(2)可以清晰地觀察到DRG神經(jīng)元軸突的微管結(jié)構(gòu),與寬場(chǎng)成像相比分辨率明顯提高。(3)可以清晰觀察到特異標(biāo)記的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)論:(1)我們建立了穩(wěn)定可靠的STORM實(shí)驗(yàn)平臺(tái)與實(shí)驗(yàn)方案,利用OriginPro8、Metlab、Adobe Illustrator CS6等軟件建立了穩(wěn)定可靠的數(shù)據(jù)處理方法。(2)我們建立了穩(wěn)定的SIM實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和固定細(xì)胞以及活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)方案。第二部分LRRC8成員間以及LRRC8A與ANO1、IP3R、caveolin-1間相互作用的研究目的:分析LRRC8家族蛋白各亞基之間的共定位情況,研究LRRC8A與ANO1、IP3R、caveolin-1間相互作用。方法:(1)建立敲除LRRC8A、LRRC8D、LRRC8E的HEK293細(xì)胞系(HEK293A~(LRRC8A-/-,LRRC8D-/-,LRRC8E-/-)),以及HEK293A~(LRRC8A-/-)、HEK293A ANO1-/-、HEK293ALRRC8A-/-,ANO1-/-細(xì)胞系。(2)在HEK293A~(LRRC8A-/-,LRRC8D-/-,LRRC8E-/-)細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染總量為300ng的LRRC8A+LRRC8D或LRRC8A+LRRC8E,以未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的上述細(xì)胞系作為對(duì)照,進(jìn)行STORM染色、成像、數(shù)據(jù)分析。(3)在HEK293A~(LRRC8A-/-)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染帶有RFP標(biāo)簽的LRRC8A質(zhì)粒,同樣地在HEK293A~(ANO1-/-)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染帶有GFP標(biāo)簽的ANO1質(zhì)粒,分別進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)染色,共聚焦顯微鏡成像,檢測(cè)兩種抗體的特異性。然后在HEK293A~(LRRC8A-/-,ANO1-/-)細(xì)胞中轉(zhuǎn)染總量為300 ng的LRRC8A和ANO1質(zhì)粒,以未轉(zhuǎn)染的上述細(xì)胞系作為對(duì)照,進(jìn)行STORM染色、成像、數(shù)據(jù)分析。(4)利用STORM在野生型HEK293A細(xì)胞中研究三磷酸肌醇受體(IP3R)和LRRC8A以及IP3R和ANO1之間的相互作用。(5)利用STORM在野生型HEK293A細(xì)胞和HEK293A~(LRRC8A-/-)細(xì)胞中研究LRRC8A和小窩蛋白-1(caveolin-1)之間的相互作用。(6)利用STORM在野生型HEK293A細(xì)胞、HEK293A~(LRRC8A-/-)細(xì)胞以及HEK293A~(LRRC8A-/-)+LRRC8A細(xì)胞中研究β-環(huán)糊精對(duì)LRRC8A和caveolin-1之間相互作用的影響。結(jié)果:(1)在缺少內(nèi)源性表達(dá)LRRC8A、LRRC8D和LRRC8E的HEK293A細(xì)胞(HEK293A~(LRRC8A-/-,LRRC8D-/-,LRRC8E-/-)),當(dāng)將上述缺失LRRC8亞基轉(zhuǎn)染表達(dá)后,利用STORM可以觀察到LRRC8A與LRRC8D、LRRC8A與LRRC8E之間明顯的相互作用。(2)來(lái)自RFP-LRRC8A和來(lái)自抗LRRC8A抗體的熒光信號(hào)具有良好的一致性,并且類(lèi)似地,來(lái)自GFP-ANO1和來(lái)自抗ANO1抗體的熒光信號(hào)具有良好的一致性,證明LRRC8A與ANO1抗體特異性較好。(3)STORM實(shí)驗(yàn)中,LRRC8A和ANO1出現(xiàn)很好的共定位。(4)LRRC8A和ANO1均與IP3R呈現(xiàn)很強(qiáng)的共定位。(5)LRRC8A和caveolin-1出現(xiàn)很好的共定位。孵育β-環(huán)糊精后,caveolin-1表達(dá)降低,與LRRC8A共定位消失。結(jié)論:(1)LRRC8A與LRRC8D和LRRC8E相互作用,形成構(gòu)成VRCC的異源多聚體。(2)ANO1與LRRC8A間存在相互作用。(3)LRRC8A與IP3R間存在相互作用,提示IP3R及細(xì)胞內(nèi)微域Ca~(2+)可能參與VRCC的激活。(4)LRRC8A與caveolin-1相互作用,當(dāng)脂筏破壞時(shí),這種相互作用消失。但是對(duì)于caveolin-1是否參與VRCC的激活還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。
【圖文】：

24圖 1 STORM 相關(guān)操作界面Fig. 1 STORM related interfaceSTORM devices include lasers, controllers, microscopes, CCD cameramercury lamps, computer workstations (left panel in A). STORM usinterface (right panel in A) as shown in the figure adjustment options for lasintensity, exposure time, frame rate, TIRF angle. The original data of thSTORM is represented by the flash point taken by each frame of the imag

圖 2 SIM 相關(guān)設(shè)備及微灌流系統(tǒng)設(shè)備Fig. 2 SIM-related equipment and micro-perfusion system equipment(A) shows the SIM system related equipment, including lasers, microscopes,cameras, controllers, computer workstations and others. (B) shows themicro-perfusion system-related equipment, including perfusion controller,temperature gas controller, cell chip culture plates, multiple control panels.
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R341

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1 梁策;用超高分辨技術(shù)分析構(gòu)成容積調(diào)控氯通道的LRRC8成員間以及LRRC8A與ANO1、IP3受體和小窩蛋白之間的相互作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

2 趙娟妮;以LRRC8A氯通道為靶點(diǎn)防治高脂喂養(yǎng)的ApoE~(-/-)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化[D];南華大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：2682525