發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 08:21

【摘要】：目的探究CXCL12對(duì)人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞遷移能力、干性及免疫調(diào)節(jié)的影響。方法1.人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:在鼻內(nèi)鏡直視下,夾取中鼻甲后方正常鼻黏膜組織,采用組織貼壁法培養(yǎng)嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞;利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)記物,免疫熒光檢測(cè)Nestin及STRO-1,對(duì)其進(jìn)行鑒定。2.培養(yǎng)至P3代,將鼻黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞消化下來(lái),并傳代培養(yǎng)于6孔板,待細(xì)胞融合度接近80%,隨機(jī)分成2組,即對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組用D/F-12加10%胎牛血清培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)組在此基礎(chǔ)上另添加100ng/mL的CXCL12重組蛋白,放入37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的C02、飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3.在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組6孔板中長(zhǎng)滿(mǎn)的細(xì)胞上用10μL移液槍頭人為制造一條粗細(xì)均勻的劃痕,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),24小時(shí)、48小時(shí)后分別對(duì)劃痕區(qū)域進(jìn)行顯微鏡下拍照。觀察其劃痕融合的情況。4.將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后,消化下來(lái),收集細(xì)胞并提取總蛋白,分別進(jìn)行CXCR4(CXCL12的受體)和Nestin的Western Blotting實(shí)驗(yàn),檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中這2種蛋白的表達(dá)差異。5.在CXCL12處理48小時(shí)后,分別收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的上清,通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)兩組細(xì)胞分泌的IL-6含量差異。結(jié)果1.培養(yǎng)的細(xì)胞呈紡錘形或長(zhǎng)條形,也可有數(shù)個(gè)分支,貼壁生長(zhǎng),融合度高時(shí)呈旋渦狀或平行生長(zhǎng),CD34、CD45表達(dá)陰性,CD73、CD90、CD105表達(dá)陽(yáng)性,且細(xì)胞純度達(dá)到97%以上,此外,免疫熒光顯示,細(xì)胞的Nestin和STRO-1表達(dá)陽(yáng)性,符合間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。2.在細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)CXCL12的處理,實(shí)驗(yàn)組劃痕融合速度較對(duì)照組快。3.在CXCR4的Western Blotting實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組表達(dá)量上調(diào),經(jīng)灰度分析,P0.01,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4.在Nestin的Western Blotting實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組表達(dá)量下調(diào),經(jīng)灰度分析,P0.01,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5.在IL-6的ELISA實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組分泌量明顯下降,P0.01,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論1.CXCL12可以直接提高嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞(OM-MSCs)的遷移能力,并且通過(guò)使OM-MSCs中的CXCR4表達(dá)上調(diào)進(jìn)一步提高OM-MSCs的遷移能力。2.CXCL12通過(guò)下調(diào)OM-MSCs中Nestin的表達(dá),降低了OM-MSCs的干性。3.CXCL12 通過(guò)下調(diào) OM-MSCs 分泌的 IL-6,改變了 OM-MSCs免疫調(diào)節(jié)的作用。
【圖文】：

ＳＴＲＯ－１的表達(dá)及間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物鑒定逡逑�。校炒诵狃つらg充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，，培養(yǎng)的細(xì)胞逡逑呈紡錘形或長(zhǎng)條形，貼壁生長(zhǎng)，ＳＴＲ０－１和Ｎｅｓｔｉｎ表達(dá)陽(yáng)性（圖３－１邋）。逡逑｜邋■■逡逑圖３－１人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及Ｎｅｓｔｉｎ和ＳＴＲＯ－１的免疫熒光實(shí)驗(yàn)逡逑Ａ．人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞：左邊黑色區(qū)域?yàn)樾狃つそM織塊，右邊旋渦狀生長(zhǎng)的細(xì)胞為人嗅逡逑黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞0４０）；邋Ｂ．ＳＴＲＯ－１染色：紅色胞體部分顯示為標(biāo)記的ＳＴＲＯ－丨，藍(lán)色為細(xì)逡逑胞核ＤＡＰＩ染色；Ｃ．邋Ｎｅｓｔｉｎ染色：綠色胞體部分顯示為標(biāo)記的Ｎｅｓｔｉｎ，藍(lán)色為細(xì)胞核ＤＡＰＩ逡逑染色。逡逑經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，ＣＤ３４、ＣＤ４５表達(dá)陰性，ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５逡逑表達(dá)陽(yáng)性，且細(xì)胞純度達(dá)到９７％以上（圖３－２），符合間充質(zhì)干細(xì)胞的逡逑鑒定標(biāo)準(zhǔn)。逡逑１８逡逑

部分進(jìn)行拍照。結(jié)果顯示，２４小時(shí)、４８小時(shí)實(shí)驗(yàn)組的劃痕融合度均逡逑較對(duì)照組高，證明實(shí)驗(yàn)組嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力在ＣＸＣＬ１２逡逑的作用下提高了（圖３－３）。逡逑１９逡逑
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2679855