【摘要】：α-甘露糖苷酶(α-mannosidase)是一種糖苷水解酶,在N-連接糖蛋白的合成和加工中具有重要作用。有關(guān)值-甘露糖苷酶的研究雖然較多,但研究對(duì)象主要集中在真核生物,對(duì)原核生物特別是病原原核生物的α-甘露糖苷酶研究相對(duì)較少。隨著特異性酶顯色技術(shù)逐步發(fā)展,酶顯色技術(shù)用于α-甘露糖苷酶活性測(cè)定成為可能。 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis臨床檢測(cè)雖然有多種方法,如細(xì)胞培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法、生化方法以及分子生物學(xué)方法,但這些方法均存在一些問(wèn)題,如細(xì)胞培養(yǎng)法和膠體金免疫法的敏感性較低,而且細(xì)胞培養(yǎng)法不易用于臨床,生化方法的特異性不強(qiáng),分子生物學(xué)方法的操作復(fù)雜及費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)等,這些問(wèn)題己嚴(yán)重影響沙眼衣原體感染的臨床檢測(cè)。 隨著顯色培養(yǎng)基技術(shù)和酶顯色技術(shù)的發(fā)展,酶法快速檢測(cè)微生物已成為目前臨床微生物檢測(cè)的一個(gè)方向。泌尿生殖道常見(jiàn)病原微生物以及沙眼衣原體多數(shù)流行株是否有α-甘露糖苷酶以及酶活性如何,將決定α-甘露糖苷酶活性對(duì)沙眼衣原體臨床檢測(cè)是否有潛在的診斷價(jià)值。如果α-甘露糖苷酶活性可以作為診斷標(biāo)志物,那么沙眼衣原體α-甘露糖酶的分離提純、α-甘露糖苷酶活性對(duì)沙眼衣原體侵染細(xì)胞是否有影響、這種影響是否有特異性以及以此建立α-甘露糖苷酶活性診斷沙眼衣原體感染方法的性能和能否產(chǎn)品化等問(wèn)題都值得深入研究。 為了詳細(xì)研究這些問(wèn)題,本論文共分為以下三個(gè)部分來(lái)闡明α-甘露糖苷酶活性在沙眼衣原體侵染細(xì)胞中的作用及其診斷價(jià)值。 第一部分泌尿生殖道常見(jiàn)微生物α-甘露糖苷酶活性研究 目的 研究泌尿生殖道常見(jiàn)微生物在α-甘露糖苷酶活性快速檢測(cè)中所表現(xiàn)活力,以期確定α-甘露糖苷酶活性對(duì)臨床沙眼衣原體感染是否有快速診斷價(jià)值。 方法 1.以泌尿生殖道常見(jiàn)的微生物包括18種細(xì)菌、7種念珠菌、2種一支原體和1種原蟲共計(jì)28株標(biāo)準(zhǔn)菌株和40株臨床分離菌株以及2株沙眼衣原體不同血清型標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行培養(yǎng)。 2.把培養(yǎng)所得的各種微生物分別以離心洗滌和不洗滌的方式收集培養(yǎng)物。 3.沙眼衣原體和化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)分別以超聲波細(xì)胞破碎和不破碎的方式收集培養(yǎng)物,白色念珠菌((landida albicans)分別以冷凍研磨破碎和不破碎的方式收集培養(yǎng)物。 4.分別以5-溴-4-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷和6-氯-3-吲哚-a-D-甘露糖苷作為α[-甘露糖苷酶顯色底物,測(cè)定各種培養(yǎng)物在37。C不同反應(yīng)時(shí)間(10、30和60min)的570nm和512nm吸光度。 結(jié)果 1.沙眼衣原體血清型D株對(duì)HeLa229細(xì)胞侵染率(被侵染的細(xì)胞占視野內(nèi)所有細(xì)胞的比率)(18.75%、24.06%和17.65%)低于沙眼衣原體血清型E株對(duì)HeLa229細(xì)胞侵染率(59.69%、62.96%和53.85%)。經(jīng)卡方檢驗(yàn),兩者侵染率概率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.273,P0.05)。 2.以5-溴-4-氯-3,吲哚-α-D-甘露糖苷和6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為α-甘露糖苷酶顯色底物,沙眼衣原體血清型D株和E株所呈現(xiàn)的α-甘露糖苷酶活性均明顯高于其他微生物的,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),α-甘露糖苷酶活性對(duì)臨床沙眼衣原體感染有快速診斷價(jià)值。陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)和部分念珠菌也表現(xiàn)微弱的α-甘露糖苷酶活性,吸光度達(dá)到0.150-0.250。 3.對(duì)各種微生物培養(yǎng)收集物在不同條件下分別得到的OD570和OD512應(yīng)用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析方法,發(fā)現(xiàn)不同的顯色底物(F=103.251,P0.05)、洗滌與否(F=88.253,P0.05)及顯色時(shí)間(F=213.235,P0.05)均對(duì)檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4.以5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為酶底物顯色慢而且淺(未破碎的沙眼衣原體血清型D株10、30和60min OD570分別為0.159、0.221和389,未破碎的沙眼衣原體血清型E株10、30和60mmin OD570分別為0.147、0.198和0.358),兩株血清型OD570的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.605,P0.05)。而以6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為酶底物顯色相對(duì)快而且深(未破碎的沙眼衣原體血清型D株10、30和60mmin OD512分別為0.519、0.607和1.826,未破碎的沙眼衣原體血清型E株10、30和60min OD512分別為0.588、0.957和2.025),兩株血清型OD512的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.845,P0.05) 第二部分沙眼衣原體α-甘露糖苷酶分離純化及酶活性對(duì)沙眼衣原體侵染細(xì)胞的影響 目的 研究沙眼衣原體α-甘露糖苷酶分離純化方法和α-甘露糖苷酶活性對(duì)沙眼衣原體侵染細(xì)胞的影響及這種影響的特異性。 方法 1.破碎的沙眼衣原體血清型D株細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)過(guò)離心、超聲波破碎、硫酸銨分級(jí)沉淀及SephadexG-100柱層析純化分離純化α-甘露糖苷酶,純化后的α-甘露糖苷酶采用SDS-PAGE鑒定酶純度并測(cè)定酶的分子量。 2.純化的α-甘露糖苷酶免疫兔子制備抗α-甘露糖苷酶血清,抗血清經(jīng)硫酸銨沉淀及Sepharose CL-4B親和層析純化后,采用免疫雙擴(kuò)散測(cè)定純化抗α-甘露糖苷酶多抗效價(jià)。 3.純化的α-甘露糖苷酶、抗α-甘露糖苷酶多抗及刀豆源的α-甘露糖苷酶分別以三種濃度(0.02、0.1和0.5mg蛋白/ml培養(yǎng)基)加入DEAE-葡聚糖溶液處理過(guò)的HeLa229單層細(xì)胞,然后接種沙眼衣原體血清型D株,培養(yǎng)后直接免疫熒光染色鏡檢觀察沙眼衣原體侵染率的差異,不加α-甘露糖苷酶和抗α-甘露糖苷酶多抗的沙眼衣原體血清型D株侵染培養(yǎng)物作為對(duì)照。 結(jié)果 1. SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)純化的沙眼衣原體血清型D株α-甘露糖苷酶電泳只有條蛋白條帶,分子量約為50kDa。 2.抗α-甘露糖苷酶血清抗體滴度為1/64,純化后,抗α-甘露糖苷酶多抗滴度也為1/64。 3.加入純化抗α-甘露糖苷酶多抗的沙眼衣原體血清型D株的侵染率與對(duì)照的侵染率總體概率分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=137.062,P0.05),而且具有隨添加濃度升高而降低的趨勢(shì)(χ2=65.328,P0.05)。加入純化α-甘露糖苷酶的沙眼衣原體血清型D株侵染率與對(duì)照的侵染率總體概率分布差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=117.539,P0.05),而且具有隨添加濃度升高而升高的趨勢(shì)(χ2=98.227,P0.05)。而加入刀豆源的α-甘露糖苷酶的沙眼衣原體血清型D株的侵染率與對(duì)照的侵染率總體概率分布差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=0.096,P0.05)。 第三部沙眼衣原體α-甘露糖苷酶活性檢測(cè)方法的建立及臨床評(píng)價(jià) 目的 以6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷作為酶顯色底物,建立適合臨床需要且能夠產(chǎn)品化的酶法沙眼衣原體檢測(cè)方法,評(píng)價(jià)其各項(xiàng)性能,為沙眼衣原體臨床診療服務(wù)。 方法 1.以基本檢測(cè)體系為基礎(chǔ),對(duì)影響配方的各因素先進(jìn)行單因素多水平試驗(yàn)及分析,再據(jù)此進(jìn)行四因素三水平正交設(shè)計(jì)與直觀分析,經(jīng)正交驗(yàn)證并結(jié)合反應(yīng)時(shí)間的調(diào)整等篩選出最佳配方,判斷的出發(fā)點(diǎn)是下面公式中的“M”值越大越好。其中M為陽(yáng)性結(jié)果OD512與干擾結(jié)果OD512的差值,AD為沙眼衣原體血清型D株培養(yǎng)物酶法檢測(cè)OD512的值,AE為沙眼衣原體血清型E株培養(yǎng)物酶法檢測(cè)OD512的值,B為兩株白色念珠菌培養(yǎng)物酶法檢測(cè)OD512的均值,C為兩株化膿性鏈球菌培養(yǎng)物酶法檢測(cè)OD512的均值。 2.確定所建立的酶法沙眼衣原體檢測(cè)限(LOD)和酶檢測(cè)限,并用尿道分泌物、宮頸分泌物、陰道分泌物、前列腺按摩液及精液標(biāo)本等多種共計(jì)665例臨床標(biāo)本初步評(píng)估陽(yáng)性率,以確定進(jìn)行臨床性能評(píng)估的標(biāo)本類型。 3.用尿道分泌物、宮頸分泌物、陰道分泌物及前列腺按摩液等多種共計(jì)553例臨床標(biāo)本評(píng)估所建立的酶法臨床性能,與細(xì)胞培養(yǎng)法及連接酶鏈反應(yīng)法(LCR)對(duì)比,參比方法采用“擴(kuò)大的金標(biāo)準(zhǔn)”即細(xì)胞培養(yǎng)和LCR兩種方法檢測(cè)結(jié)果中有一個(gè)陽(yáng)性即為真陽(yáng)性,而不論酶法結(jié)果如何。 4.確定所建立的酶法及質(zhì)控參考品有效期。 結(jié)果 1.正交分析固紫B鹽濃度影響最大,而0.1mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液pH則影響最小。但正交驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)正交表中的實(shí)驗(yàn)6所采用的配方優(yōu)于直觀分析的最佳水平組合,考慮檢測(cè)時(shí)間的臨床價(jià)值以及在此基礎(chǔ)上Triton X-100濃度的影響,在37℃孵育15min的反應(yīng)條件下,篩選最佳配方為：顯色劑為2mg/ml6-氯-3-吲哚-α-D-甘露糖苷溶液,溶劑為含0.75%(v/v)TritonX-100的0.1mol/L、pH4.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；固紫B鹽溶液濃度為1.5mg/ml,溶劑為生理鹽水；樣品稀釋液為不含底物的顯色劑。 2.酶法沙眼衣原體檢測(cè)限和酶檢測(cè)限分別是617IFU/ml和10-3u/ml,尿道分泌物、宮頸分泌物、陰道分泌物、前列腺按摩液和精液標(biāo)本的陽(yáng)性率分別是11.11%、12.74%、9.91%、27.27%和93.33%,說(shuō)明精液對(duì)酶法有干擾,前列腺按摩液也可能有干擾。 3.前列腺按摩液有干擾,但排除前列腺按摩液標(biāo)本后,酶法檢測(cè)沙眼衣原體靈敏度和特異性分別是91.8%(95%CI,86.0%-97.6%)和98.3%(95%CI,97.1%-99.5%),與擴(kuò)大的金標(biāo)準(zhǔn)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4. α-甘露糖苷酶法檢測(cè)體系產(chǎn)品2℃-8℃貯存有效期為23個(gè)月,質(zhì)控參考品-20℃貯存有效期為5.5個(gè)月。 結(jié)論 1. α-甘露糖苷酶活性對(duì)沙眼衣原體感染是有潛在價(jià)值的診斷標(biāo)志物。 2.純化后的沙眼衣原體血清型D株α-甘露糖苷酶分子量約為50kDa。 3.α-甘露糖苷酶活性的高低可明顯特異性地影響沙眼衣原體血清型D株侵染敏感細(xì)胞能力。 4.本文建立的快速檢測(cè)α-甘露糖苷酶活性的方法,可用于診斷沙眼衣原體感染的臨床診斷,具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R374

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2679386