本文關(guān)鍵詞：人間充質(zhì)干細胞內(nèi)源性抗氧化水平影響干細胞存活的分子機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:本研究旨在探討人間充質(zhì)干細胞內(nèi)源性抗氧化水平影響干細胞存活的分子機制。方法:利用細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)/雙氧水(H2O2)協(xié)同誘導了一個與體內(nèi)環(huán)境相似的體外氧化炎癥壓力環(huán)境。應用依達拉奉作為抗氧化劑和馬來酸二乙酯(diethylmaleate,DEM)作為促氧化劑預處理人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)后的不同時間點,測定干細胞存活能力、細胞凋亡和內(nèi)源性抗氧化水平的動態(tài)變化。其中,采用免疫熒光染色法和caspase-3/7活性法測定細胞凋亡的變化;用MTT評估細胞活性;用活性氧(reactive oxygen species,ROS)染色和GSH/GSSH比值顯示細胞內(nèi)抗氧化水平。然后,用定量PCR系統(tǒng)檢測細胞抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax-1的m RNA表達水平變化;用蛋白免疫印跡法(Western blot,WB)測定內(nèi)源性抗氧化酶中超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase-1,SOD1)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和MAPK、PKC通路各蛋白的表達變化;用試劑盒測定Nrf2轉(zhuǎn)錄活性,以期對調(diào)控干細胞凋亡和內(nèi)源性抗氧化水平的分子機制進行探究。最后,用PD98059和staurosporine分別阻斷MAPK和PKC通路;用基因沉默的方法阻斷Nrf2的抑制蛋白質(zhì)Keap1的表達,進一步驗證MAPK-PKC-Nrf2通路在影響干細胞內(nèi)源性抗氧化水平中的作用。結(jié)果:(1)與對照組比較,LPS/H2O2處理組干細胞活性降低(P0.05);與LPS/H2O2組比較,促氧化劑DEM預處理后在所有時間點都進一步降低了干細胞活性(P0.05);與LPS/H2O2組比較,兩種不同濃度的依達拉奉處理組(Eda)均提高了LPS/H2O2刺激下干細胞的增殖活性,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),且兩組Eda濃度間比較無統(tǒng)計學差異(P0.05);此外,依達拉奉預處理改善了由LPS/H2O2刺激導致的h UCMSCs細胞形態(tài)的異常,而DEM則進一步加劇該異常;(2)結(jié)果顯示與LPS/H2O2處理組比較,依達拉奉預處理組的10μM和20μM濃度組均降低了h UCMSCs細胞凋亡率,DEM預處理組增高了h UCMSCs細胞凋亡率,二者均有統(tǒng)計學意義(P0.05;P0.001);caspa se-3/7的活性變化與細胞凋亡率變化一致;q PCR結(jié)果顯示,與對照組比較,在處理后12、24、36、48、60、72小時(h)后,LPS/H2O2組的抗凋亡蛋白Bcl-2的m RNA表達率低,而促凋亡蛋白Bax1的m RNA表達率增高(P0.001);不同濃度的依達拉奉預處理后,可以抵消這種作用;DEM預處理后,進一步降低了Bcl-2和提高了Bax1的水平;(3)從處理后24h開始,與對照組比較,LPS/H2O2組培養(yǎng)基中DCFH-D A(ROS熒光染色劑)信號更明顯,依達拉奉預處理組減弱,而DEM預處理組加劇;GSH/GSSG比值變化與ROS表達情況相符:與對照組比較,在處理后12、24、36、48、72h時,LPS/H2O2組均引起胞內(nèi)GSH/GSSG比率降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.001);這種降低在依達拉奉組(10μM和20μM)被抵消,而在DEM組更低;(4)Western Blot結(jié)果顯示,與對照組比較,LPS/H2O2處理后的12、24、36、60和72 h,過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶1(SOD1)蛋白的表達顯著降低,尤其是SOD1的表達;與LPS/H2O2組比較,依達拉奉預處理組蛋白表達高,DEM預處理組蛋白表達低(P0.05);(5)測定MAPK通路結(jié)果顯示:與對照組比較,LPS/H2O2處理組在大部分時間點表達更高水平的磷酸化的p38MAPK和ERK1/2。依達拉奉預處理組及DEM預處理組分別可以消除和增強LPS/H2O2的該效應;用PD98059和PKC抑制劑分別阻斷MAPK和PKC通路后,20μM依達拉奉組對細胞活性降低的升高作用被消除;應用基因沉默Keap1可以增強Nrf2的活性(P0.001),并可以部分逆轉(zhuǎn)DEM對細胞活性的影響。結(jié)論:(1)抗氧化劑依達拉奉預處理改善了氧化炎癥刺激下h UCMSCs的形態(tài)學和生存能力;(2)抗氧化劑依達拉奉預處理后通過上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2 m RNA的水平和下調(diào)促凋亡基因Bax-1 m RNA水平降低h UCMSCs的凋亡率;(3)抗氧化劑依達拉奉預處理后的h UCMSCs,通過修復氧化炎癥刺激導致的內(nèi)源性抗氧化酶活性損傷,提高干細胞內(nèi)源性抗氧化水平;(4)干細胞部分通過調(diào)控自身MAPK-PKC-Nrf2通路的變化調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化水平。
【關(guān)鍵詞】：人臍帶間充質(zhì)干細胞 抗氧化 機制
【學位授予單位】：南華大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 主要英文縮略語索引14-15
• 第1章 緒論15-19
• 第2章 材料與方法19-37
• 2.1 試劑和儀器19-22
• 2.1.1 主要試劑19-20
• 2.1.2 主要抗體20-21
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備21
• 2.1.4 主要試劑配制21-22
• 2.2 研究對象22
• 2.3 研究方法22-35
• 2.3.1 技術(shù)路線22-23
• 2.3.2 h UCMSCs的分離和培養(yǎng)23-25
• 2.3.3 h UCMSCs的處理25-26
• 2.3.4 MTT測定細胞活性26
• 2.3.5 免疫熒光染色觀察細胞凋亡及形態(tài)26-27
• 2.3.6 Caspase-3/7 活性測定27
• 2.3.7 R1NA提取和定量PCR分析27-30
• 2.3.8 ROS染色30
• 2.3.9 GSH/GSSG比率測定30
• 2.3.10 細胞總蛋白提取及蛋白免疫印跡法30-34
• 2.3.11 Nrf2活性測定34
• 2.3.12 阻斷ERK, PKC和Keap1通路34-35
• 2.4 數(shù)據(jù)分析35-37
• 第3章 結(jié)果37-45
• 3.1 各組h UCMSCs的細胞活性和形態(tài)學比較37
• 3.2 凋亡率及caspase-3/7 活性與凋亡基因Bcl-2 及Bax137-39
• 3.3 胞內(nèi)GSH/GSSG比值及ROS表達水平變化39-41
• 3.4 內(nèi)源性抗氧化酶CAT和SOD1的表達41-42
• 3.5 MAPK,PKC和Nrf2通路變化42-45
• 第4章 討論45-49
• 第5章 結(jié)論49-51
• 參考文獻51-55
• 附錄 (綜述)55-63
• 參考文獻60-63
• 作者攻讀學位期間的科研成果63-65
• 致謝65

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 曾文;肖佳;侯q，

本文編號：267583