【摘要】：目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有多向分化潛能的細(xì)胞,可在體外長時間保持未分化狀態(tài),增殖能力強(qiáng),易于在體外大量培養(yǎng),可以特異遷移到損傷部位及腫瘤局部,向骨組織,心肌,軟骨組織,肌肉組織等分化,對心肌梗死,腦梗死,急慢性肝功能衰竭等具有一定的治療作用,顯示了其強(qiáng)大的應(yīng)用前景。然而,盡管骨髓中MSCs含量相對較多,但仍難以滿足細(xì)胞治療的需要,故常需要在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增才能滿足要求。已有研究顯示,MSCs移植后在體內(nèi)的歸巢能力,會隨著供體細(xì)胞在體外的培養(yǎng)傳代而下降。歸巢能力的下降又會進(jìn)一步影響到MSCs在靶向組織中的植入,從而嚴(yán)重影響了MSCs對靶組織的修復(fù)作用。因此,提高M(jìn)SCs向靶向組織的特異性歸巢,是提高干細(xì)胞移植療效的關(guān)鍵。MSCs表面可檢測到CXCR4,CXCR6, CXCL12(SDF-1),CD44等細(xì)胞因子的表達(dá),其中CXCR4/SDF-1軸的作用已被證實在MSCs的歸巢中起到重要作用。 本實驗旨在通過體外分離培養(yǎng)健康人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察不同代次細(xì)胞的生長特點(diǎn)；分析不同代次細(xì)胞CXCR4,CXCR6,CXCL12,CD44表達(dá)的差異,初步探究體外擴(kuò)增傳代對MSCs歸巢能力影響的機(jī)制。 方法：應(yīng)用Ficoll密度梯度離心法將MSCs目骨髓中分離出來,利用其貼壁生長的特性加以純化,在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至第7代,觀察原代及第3、5、7代細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。采用MTT法檢測第3、5、7代MSCs的生長增殖特性,并繪制生長曲線。Real-time PCR法檢測第3、5、7代MSCs中CXCR4,CXCR6, CXCL12,CD44的表達(dá),記錄每個樣品的目的基因和內(nèi)參β-actin的Ct值,計算相應(yīng)的△Ct(△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因),以及△△Ct(△△Ct=△Cta一△Ctb),最后計算2-△△Ct得到各代細(xì)胞目的基因的相對表達(dá)率,即不同代次MSCs中各細(xì)胞因子表達(dá)的差異倍數(shù)。所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行分析。采用配對t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,p0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：MSCs原代細(xì)胞呈長梭形,細(xì)胞形態(tài)均一,擴(kuò)增速度快,克隆形成能力強(qiáng),體外培養(yǎng)1至2周可傳代。傳代后細(xì)胞生長速度明顯加快,24小時內(nèi)完全貼壁、伸展,重新變?yōu)殚L梭形,生長潛伏期較短(1-2天),培養(yǎng)4-7天即達(dá)到完全融合。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外的增殖能力較強(qiáng),但隨著傳代擴(kuò)增次數(shù)增加,其形態(tài)從細(xì)長梭形逐漸縮短變寬,增殖速率及總體擴(kuò)增倍數(shù)亦隨傳代呈下降趨勢。MSCs表達(dá)CXCR4,CXCR6,CXCL12,CD44,但其表達(dá)量隨傳代而下降。對于CXCR4而言,第5代MSCs的表達(dá)為第3代的53.18%,而第7代的表達(dá)僅為第3代的27.04%,且第3、5、7代MSCs中CXCR4的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。對于CXCL12而言,第5代MSCs的表達(dá)為第3代的56.59%,而第7代的表達(dá)量僅為第3代的27.41%,且第3、5、7代MSCs中CXCL12的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。對于CXCR6,第5代MSCs中的表達(dá)為第3代的76.37%,第7代的表達(dá)為第3代的42.12%,其中第3代與第7代,第5代與第7代MSCs中CXCR6的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。第5代相比第3代MSCs中CXCR6的表達(dá)具有下降趨勢,增大樣本量可能獲得統(tǒng)計學(xué)意義。對于CD44,第5代MSCs中的表達(dá)為第3代的53.99%,第7代的表達(dá)僅為為第3代的23.56%。其中第3代與第5代,第3代與第7代MSCs中CD44的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。第7代相比第5代MSCs中CD44的表達(dá)下降趨勢明顯,增大樣本量可能獲得統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：體外培養(yǎng)可獲得較高純度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,易于培養(yǎng)擴(kuò)增,在體外的增殖能力較強(qiáng),但增殖速率及總體擴(kuò)增倍數(shù)隨傳代下降。其歸巢相關(guān)因子的表達(dá)亦隨傳代培養(yǎng)而下降,提示間充質(zhì)干細(xì)胞的歸巢能力隨擴(kuò)增傳代下降可能與CXCR4,CXCR6,CXCL12(SDF-1),CD44等歸巢相關(guān)因子在MSCs中的表達(dá)水平下降相關(guān)。
【圖文】：

5rnlFicoll分離液上（下層為Ficoll細(xì)胞分離液，上層為骨髓標(biāo)本，兩者勿混合）。(5)常溫下，，以2200r/min離心25分鐘，離心管中形成密度梯度（圖1)。(6)取界面層細(xì)胞，轉(zhuǎn)入新的15ml離心管中，加入lOmlPBS，吹打混勻后，常溫1500r/min離心5分鐘，棄上清。(7)再次加入lOmlPBS,吹打混勻后，常溫1500r/min離心5分鐘，棄上清。(8)以DMEM-F12培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1%雙抗）重懸細(xì)胞

(3)計數(shù)將計數(shù)板放在低倍鏡下（10X10倍）觀察計數(shù)。按圖2計算計數(shù)板的四角大方格（每個大方格又分16個小方格）內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。計數(shù)時只計數(shù)完整的細(xì)胞，若聚成一團(tuán)的細(xì)胞則按一個細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。在一個大方格中，如果有細(xì)胞位于線上，一般計上線細(xì)胞不計下線細(xì)胞，計左線細(xì)胞不計右線細(xì)胞。二次重復(fù)計數(shù)誤差不應(yīng)超過+5%。(4)計數(shù)的換算計數(shù)后，需換算出每ml懸液中的細(xì)胞數(shù)。由于計數(shù)板中每一方格的面積為9
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 代飛,吳軍,許建中,王序全,尹芝華;兩種從骨髓中分離人間充質(zhì)干細(xì)胞方法的比較研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年16期

2 向國安,張剛慶,方馳華,高鵬,陳開運(yùn);同種異體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植在大鼠肝內(nèi)定居能力初步研究[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2005年08期

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本文編號：2675229