【摘要】：背景:人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,hPIV3)與新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是副粘病毒(Paramyxovirus)的典型代表,并且兩者結(jié)構(gòu)高度類似,其中hPIV3主要引起人類呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病,NDV通過被感染禽類的口腔粘液及糞便傳播,導(dǎo)致禽類發(fā)生呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有高度致死性,人類接觸被感染禽類亦可導(dǎo)致淋巴腺炎及結(jié)膜炎,針對(duì)這兩種病毒的感染至今仍然沒有有效的防治措施,主要原因在于尚未明確致病機(jī)制中病毒與靶細(xì)胞的融合機(jī)制。血凝素-神經(jīng)氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(Fusion protein,F)是鑲嵌在副粘病毒包膜上的兩種糖蛋白,由病毒基因編碼產(chǎn)生的。兩者的相互作用是決定病毒宿主范圍、毒力和傳播的關(guān)鍵,并且HN與F的相互作用區(qū)定位于HN的頸部,目前關(guān)于HN頸部與F相互作用區(qū)(Fusion interaction region,FIR)的各個(gè)氨基酸的功能尚不清楚。在本研究中,選取NDV HN及hPIV3 HN作為研究對(duì)象,將HN頸部與F相互作用區(qū)互相置換,構(gòu)建嵌合體。通過比對(duì)HN頸部與F相互作用區(qū)序列,進(jìn)一步確定了該區(qū)域存在的兩個(gè)保守氨基酸位點(diǎn),即第51位絲氨酸(Serine,S51)和第55位天冬氨酸(Aspartic acid,D55),并將其突變?yōu)楸彼?Alanine,A)。通過檢測(cè)嵌合體及突變體功能的改變,明確頸部與F相互作用區(qū)對(duì)HN功能的影響及在這一區(qū)域中起關(guān)鍵作用的氨基酸位點(diǎn),分析導(dǎo)致HN功能發(fā)生變化的原因,進(jìn)一步加深對(duì)副粘病毒HN頸部在細(xì)胞融合機(jī)制中作用的理解。目的:1.確定HN頸部與F相互作用區(qū)(FIR)對(duì)于HN在促細(xì)胞融合機(jī)制中發(fā)揮作用產(chǎn)生的影響。2.定位HN頸部與F相互作用區(qū)的關(guān)鍵氨基酸。3.進(jìn)一步探討HN頸部與F相互作用的機(jī)制。方法:1.采用片段置換與同源重組相結(jié)合的方法,將NDV HN的頸部與F相互作用區(qū)置換為hPIV3的HN頸部與F相互作用區(qū),構(gòu)建嵌合體C1;同理,將hPIV3的HN頸部與F相互作用區(qū)置換為NDV HN的頸部與F相互作用區(qū),構(gòu)建嵌合體C2。2.通過定點(diǎn)突變與同源重組相結(jié)合的方法,將NDVHN頸部與F相互作用區(qū)的保守氨基酸,即第51位絲氨酸(S51)、第55位天冬氨酸(D55),均突變?yōu)楸彼?A),各突變體分別命名為NDVS51A、NDVD55A;hPIV3HN頸部與F相互作用區(qū)的保守氨基酸S51、D55均突變?yōu)楸彼岷?分別命名為hPIV3 S51A、hPIV3D55A。3.將嵌合體及突變體通過真核瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。4.檢測(cè)蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)效率:通過流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)定量測(cè)定各嵌合體及突變體在細(xì)胞表面表達(dá)效率;間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence,IFA)定性測(cè)定各嵌合體及突變體在細(xì)胞表面表達(dá)效率。5.檢測(cè)促細(xì)胞融合活性:采用姬姆薩(Giemsa)染色法定性觀察嵌合體及突變體引起細(xì)胞融合情況,指示基因法定量測(cè)定嵌合體及突變體的促細(xì)胞融合活性。6.檢測(cè)受體識(shí)別活性:通過血吸附(Hemadsorption,HAD)實(shí)驗(yàn)定性測(cè)定各嵌合體、突變體受體識(shí)別活性,之后將吸附的紅細(xì)胞裂解通過比色定量測(cè)定各嵌合體、突變體的受體識(shí)別活性。7.檢測(cè)神經(jīng)氨酸酶活性:通過神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒,利用β-半乳糖苷酶與嵌合體及突變體發(fā)生酶促反應(yīng),定量測(cè)定神經(jīng)氨酸酶活性。8.半融合試驗(yàn):通過R18熒光探針標(biāo)記的新鮮紅細(xì)胞懸液進(jìn)行半融合試驗(yàn),檢測(cè)嵌合體及突變體對(duì)膜融合早期階段產(chǎn)生何種影響。結(jié)果:1.DNA測(cè)序結(jié)果表明,NDV HN及hPIV3 HN頸部與F相互作用區(qū)的氨基酸片段已互相置換,嵌合體C1、C2構(gòu)建成功,指定位點(diǎn)氨基酸已突變?yōu)楸彼?突變體質(zhì)粒 NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 均定點(diǎn)突變成功。2.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的細(xì)胞表面表達(dá)效率分別為野生型的82.1%、81.8%、90.2%、88.3%、84.9%、92.8%,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)3.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的促細(xì)胞融合活性均有不同程度的下降,分別為野生型的7%、9%、27%、19%、17%和21%,差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),C1、C2促細(xì)胞融合活性基本喪失。4.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的受體識(shí)別活性均有不同程度下降,分別為野生型的14.7%、22.3%、35.5%、28.8%、33.9%和40.2%,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的神經(jīng)氨酸酶活性分別為野生型的75.9%、80.5%、84.7%、72.7%、75.3%、73.4%,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的半融合能力均下降,其中C1、C2半融合能力下降程度大。結(jié)論:1.副粘病毒HN頸部與F相互作用區(qū)對(duì)其發(fā)揮促細(xì)胞融合活性和受體識(shí)別合活性具有重要意義。2.hPIV3 HN、NDVHN頸部與F相互作用區(qū)中的關(guān)鍵氨基酸為第51位絲氨酸(S51)、第55位天冬氨酸(D55)。3.HN頸部與F相互作用區(qū)的嵌合體及突變體促細(xì)胞融合活性降低的原因可能為受體識(shí)別活性的降低阻滯了頭-頸之間信號(hào)的傳遞,使頸部與F相互作用區(qū)未得到充分暴露,影響HN與F的相互作用。
【圖文】：

圖１邋ＮＤＶ及ｈＰＩＶ３頸部與Ｆ相互作用區(qū)序列逡逑背景高亮的Ｓ５１和Ｄ５５高度保守逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋Ｆ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｒｅｇｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｔａｌｋ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＨＮ逡逑Ｓ５１邋ａｎｄ邋Ｄ５５邋ａｒｅ邋ｈｉｇｈｌｙ邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ａｎｄ邋ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ａ邋ｒｅｄ邋ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．逡逑

箭頭所指為合胞體，Ａ．ＮＤＶＨＮ嵌合體及突變體；Ｂ．ｈＰＩＶ３ＨＮ嵌合體及突變體逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｇｉｅｍｓａ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｃｈｉｍｅｒａｓ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ，逡逑Ａｒｒｏｗｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｔｈｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ，，邋Ａ．邋ＮＤＶ邋ＨＮ邋ｃｈｉｍｅｒａ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ．邋Ｂ．邋ｈＰＩＶ３逡逑ＨＮ邋ｃｈｉｍｅｒａ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ．逡逑４１逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 火文;白慕群;;人3型副流感病毒及其疫苗的研究進(jìn)展[J];微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展;2015年04期

2 丁壯;尹仁福;薛聰;王建忠;錢晶;;新城疫流行病學(xué)新特點(diǎn)及鵝新城疫防控策略[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2015年01期

3 孫敏華;胡奇林;;新城疫病毒分子流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年12期

本文編號(hào)：2674862