【摘要】：背景:人副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3,hPIV3)與新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是副粘病毒(Paramyxovirus)的典型代表,并且兩者結(jié)構(gòu)高度類似,其中hPIV3主要引起人類呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病,NDV通過被感染禽類的口腔粘液及糞便傳播,導致禽類發(fā)生呼吸系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病,具有高度致死性,人類接觸被感染禽類亦可導致淋巴腺炎及結(jié)膜炎,針對這兩種病毒的感染至今仍然沒有有效的防治措施,主要原因在于尚未明確致病機制中病毒與靶細胞的融合機制。血凝素-神經(jīng)氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase,HN)和融合蛋白(Fusion protein,F)是鑲嵌在副粘病毒包膜上的兩種糖蛋白,由病毒基因編碼產(chǎn)生的。兩者的相互作用是決定病毒宿主范圍、毒力和傳播的關(guān)鍵,并且HN與F的相互作用區(qū)定位于HN的頸部,目前關(guān)于HN頸部與F相互作用區(qū)(Fusion interaction region,FIR)的各個氨基酸的功能尚不清楚。在本研究中,選取NDV HN及hPIV3 HN作為研究對象,將HN頸部與F相互作用區(qū)互相置換,構(gòu)建嵌合體。通過比對HN頸部與F相互作用區(qū)序列,進一步確定了該區(qū)域存在的兩個保守氨基酸位點,即第51位絲氨酸(Serine,S51)和第55位天冬氨酸(Aspartic acid,D55),并將其突變?yōu)楸彼?Alanine,A)。通過檢測嵌合體及突變體功能的改變,明確頸部與F相互作用區(qū)對HN功能的影響及在這一區(qū)域中起關(guān)鍵作用的氨基酸位點,分析導致HN功能發(fā)生變化的原因,進一步加深對副粘病毒HN頸部在細胞融合機制中作用的理解。目的:1.確定HN頸部與F相互作用區(qū)(FIR)對于HN在促細胞融合機制中發(fā)揮作用產(chǎn)生的影響。2.定位HN頸部與F相互作用區(qū)的關(guān)鍵氨基酸。3.進一步探討HN頸部與F相互作用的機制。方法:1.采用片段置換與同源重組相結(jié)合的方法,將NDV HN的頸部與F相互作用區(qū)置換為hPIV3的HN頸部與F相互作用區(qū),構(gòu)建嵌合體C1;同理,將hPIV3的HN頸部與F相互作用區(qū)置換為NDV HN的頸部與F相互作用區(qū),構(gòu)建嵌合體C2。2.通過定點突變與同源重組相結(jié)合的方法,將NDVHN頸部與F相互作用區(qū)的保守氨基酸,即第51位絲氨酸(S51)、第55位天冬氨酸(D55),均突變?yōu)楸彼?A),各突變體分別命名為NDVS51A、NDVD55A;hPIV3HN頸部與F相互作用區(qū)的保守氨基酸S51、D55均突變?yōu)楸彼岷?分別命名為hPIV3 S51A、hPIV3D55A。3.將嵌合體及突變體通過真核瞬時表達系統(tǒng)進行表達。4.檢測蛋白在細胞表面的表達效率:通過流式細胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)定量測定各嵌合體及突變體在細胞表面表達效率;間接免疫熒光(Indirect immunofluorescence,IFA)定性測定各嵌合體及突變體在細胞表面表達效率。5.檢測促細胞融合活性:采用姬姆薩(Giemsa)染色法定性觀察嵌合體及突變體引起細胞融合情況,指示基因法定量測定嵌合體及突變體的促細胞融合活性。6.檢測受體識別活性:通過血吸附(Hemadsorption,HAD)實驗定性測定各嵌合體、突變體受體識別活性,之后將吸附的紅細胞裂解通過比色定量測定各嵌合體、突變體的受體識別活性。7.檢測神經(jīng)氨酸酶活性:通過神經(jīng)氨酸酶檢測試劑盒,利用β-半乳糖苷酶與嵌合體及突變體發(fā)生酶促反應(yīng),定量測定神經(jīng)氨酸酶活性。8.半融合試驗:通過R18熒光探針標記的新鮮紅細胞懸液進行半融合試驗,檢測嵌合體及突變體對膜融合早期階段產(chǎn)生何種影響。結(jié)果:1.DNA測序結(jié)果表明,NDV HN及hPIV3 HN頸部與F相互作用區(qū)的氨基酸片段已互相置換,嵌合體C1、C2構(gòu)建成功,指定位點氨基酸已突變?yōu)楸彼?突變體質(zhì)粒 NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 均定點突變成功。2.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的細胞表面表達效率分別為野生型的82.1%、81.8%、90.2%、88.3%、84.9%、92.8%,差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)3.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的促細胞融合活性均有不同程度的下降,分別為野生型的7%、9%、27%、19%、17%和21%,差別均具有統(tǒng)計學意義(P0.05),C1、C2促細胞融合活性基本喪失。4.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的受體識別活性均有不同程度下降,分別為野生型的14.7%、22.3%、35.5%、28.8%、33.9%和40.2%,差別有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的神經(jīng)氨酸酶活性分別為野生型的75.9%、80.5%、84.7%、72.7%、75.3%、73.4%,差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。6.C1、C2、NDVS51A、NDVD55A、hPIV3S51A、hPIV3D55A 的半融合能力均下降,其中C1、C2半融合能力下降程度大。結(jié)論:1.副粘病毒HN頸部與F相互作用區(qū)對其發(fā)揮促細胞融合活性和受體識別合活性具有重要意義。2.hPIV3 HN、NDVHN頸部與F相互作用區(qū)中的關(guān)鍵氨基酸為第51位絲氨酸(S51)、第55位天冬氨酸(D55)。3.HN頸部與F相互作用區(qū)的嵌合體及突變體促細胞融合活性降低的原因可能為受體識別活性的降低阻滯了頭-頸之間信號的傳遞,使頸部與F相互作用區(qū)未得到充分暴露,影響HN與F的相互作用。
【圖文】：

圖１邋ＮＤＶ及ｈＰＩＶ３頸部與Ｆ相互作用區(qū)序列逡逑背景高亮的Ｓ５１和Ｄ５５高度保守逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋Ｆ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｒｅｇｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｔａｌｋ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＨＮ逡逑Ｓ５１邋ａｎｄ邋Ｄ５５邋ａｒｅ邋ｈｉｇｈｌｙ邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ａｎｄ邋ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ａ邋ｒｅｄ邋ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ．逡逑

箭頭所指為合胞體，Ａ．ＮＤＶＨＮ嵌合體及突變體；Ｂ．ｈＰＩＶ３ＨＮ嵌合體及突變體逡逑Ｆｉｇ．３邋Ｇｉｅｍｓａ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｃｈｉｍｅｒａｓ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ，逡逑Ａｒｒｏｗｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｔｈｅ邋ｆｏｒｍａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｙｎｃｙｔｉｕｍ，，邋Ａ．邋ＮＤＶ邋ＨＮ邋ｃｈｉｍｅｒａ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ．邋Ｂ．邋ｈＰＩＶ３逡逑ＨＮ邋ｃｈｉｍｅｒａ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｎｔｓ．逡逑４１逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 火文;白慕群;;人3型副流感病毒及其疫苗的研究進展[J];微生物學免疫學進展;2015年04期

2 丁壯;尹仁福;薛聰;王建忠;錢晶;;新城疫流行病學新特點及鵝新城疫防控策略[J];中國獸醫(yī)學報;2015年01期

3 孫敏華;胡奇林;;新城疫病毒分子流行病學研究進展[J];動物醫(yī)學進展;2010年12期

本文編號：2674862