【摘要】：背景與目的 炎癥影響成骨分化研究現(xiàn)狀 我國(guó)每年骨折患者約有5000萬(wàn)人,其中骨不連的發(fā)病率約為2%～5%。臨床大部分骨不連由開放性骨折感染導(dǎo)致,其產(chǎn)生的疼痛、肢體功能和心理障礙等給患者帶來(lái)極大痛苦,同時(shí)也增加患者和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此針對(duì)骨不連的機(jī)制研究成為目前的熱點(diǎn)。骨形成過程為成骨細(xì)胞活性與破骨細(xì)胞活性相互拮抗制約、矛盾統(tǒng)一的平衡過程,其中成骨細(xì)胞由間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)分化而來(lái),主要合成骨基質(zhì)；破骨細(xì)胞由骨髓單核巨噬細(xì)胞分化演變而成,主要降解骨基質(zhì)。骨折愈合過程需要大量新生成骨細(xì)胞,進(jìn)而加快骨質(zhì)合成與鈣化,增加骨體積與密度。目前對(duì)于慢性持續(xù)性炎癥刺激可以促進(jìn)骨吸收的相關(guān)研究已較為成熟,但慢性持續(xù)性炎癥刺激在骨形成過程中對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響,尤其對(duì)MSC分化為成骨細(xì)胞的影響至今卻所知甚少。盡管學(xué)者們不斷探索,然而到目前為止,炎癥微環(huán)境下成骨細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制仍尚未完全了解。 作為機(jī)體的一種防御反應(yīng),正常生理性炎癥反應(yīng)有利于骨折愈合。但由于感染或其它因素等引起的長(zhǎng)期慢性炎癥反應(yīng)則對(duì)骨折愈合則毫無(wú)益處。目前研究已證實(shí)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、雌激素缺乏或者老化等患者血液中腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)的表達(dá)量均有所提高。作為體內(nèi)最重要的促炎性細(xì)胞因子之一,TNF-α除參與介導(dǎo)免疫應(yīng)答外,還通過誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)外周組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和功能活性影響組織器官的發(fā)育和功能。而TNF-α對(duì)成骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)則表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：(1)TNF-α直接抑制成骨細(xì)胞的分化成熟及成骨；(2) TNF-α刺激成骨細(xì)胞分泌破骨性調(diào)節(jié)因子進(jìn)而促進(jìn)骨吸收；(3) TNF-α誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡、減少其數(shù)目從而抑制骨形成；(4) TNF-α影響其他促分化細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子對(duì)成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。體外實(shí)驗(yàn)?zāi)壳耙炎C實(shí)TNF-α可抑制成骨細(xì)胞關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子如Runx2和Osterix因子的表達(dá)。其中TNF-α對(duì)Runx2的抑制作用主要通過造成Runx2mRNA的失穩(wěn)定進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡；并且TNF-α還通過對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)的Smurfl和Smurf2因子的增量調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)Runx2的降解。而TNF-α對(duì)Osterix抑制則通過獨(dú)立的機(jī)制,即通過包括MAPK,神經(jīng)酰胺和氧自由基等信號(hào)傳導(dǎo)通路間接抑制Osterix活性,進(jìn)而抑制成骨細(xì)胞分化。盡管如此,TNF-α抑制成骨細(xì)胞的機(jī)制復(fù)雜仍不甚清楚。因此探索炎癥刺激影響成骨細(xì)胞分化的機(jī)制,尋找潛在的理想藥靶阻止炎癥因子對(duì)骨再生的抑制,一直是該研究領(lǐng)域密切關(guān)注并亟待解決的問題。 蛋白質(zhì)組學(xué)在成骨分化研究方面的研究 炎癥刺激作用下成骨細(xì)胞分化的過程存在復(fù)雜精密的調(diào)節(jié)體系,涉及諸多信號(hào)通路的調(diào)控�？紤]到信號(hào)通路之間存在的交談(cross talk)作用,加之既往研究多通過某一條或某幾條通路入手,因此難以全面地解釋成骨細(xì)胞在炎癥刺激作用下的分化過程。同時(shí)前期的研究多數(shù)通過單個(gè)靶點(diǎn)阻斷單一信號(hào)通路干預(yù)炎癥對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制。而多靶點(diǎn)組成的靶場(chǎng)干預(yù)應(yīng)該是阻止炎癥因子對(duì)骨再生抑制的發(fā)展方向。只有通過對(duì)炎癥刺激影響成骨細(xì)胞分化的機(jī)制深入了解,發(fā)現(xiàn)潛在的特異性和可藥性靶標(biāo),才能做到有的放矢,針對(duì)組合靶標(biāo)開發(fā)新的促進(jìn)炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化的藥物。 后基因組時(shí)代,蛋白質(zhì)作為生物功能的執(zhí)行者已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)機(jī)體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、蛋白修飾與功能、蛋白之間的相互作用等進(jìn)行高通量的篩選和分析,比傳統(tǒng)的單個(gè)基因研究或單個(gè)蛋白研究更能增加疾病診斷、預(yù)后判斷的可靠性,更能夠準(zhǔn)確反映機(jī)體的狀態(tài)。如果運(yùn)用傳統(tǒng)的生化技術(shù)手段一個(gè)個(gè)地去研究這些蛋白質(zhì),工作量非常巨大,幾乎不可能完成,而找到一些新的發(fā)病機(jī)理就顯得更加困難。因此作為一種全新的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法,蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為揭示炎癥影響成骨細(xì)胞分化的機(jī)制提供了強(qiáng)有力的幫助。目前在成骨細(xì)胞的研究方面,蛋白質(zhì)組學(xué)分析主要集中于兩類內(nèi)容：1)間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨細(xì)胞分化的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,找到差異表達(dá)的蛋白并進(jìn)行機(jī)制探索；2)利用試驗(yàn)動(dòng)物,研究各種生物及機(jī)械刺激對(duì)成骨細(xì)胞的形成以探討成骨細(xì)胞的各種反應(yīng)機(jī)制。以上成骨細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究取得了很多進(jìn)展與突破,初步揭示了成骨細(xì)胞形成的部分分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)了一些與成骨細(xì)胞分化的相關(guān)蛋白。但上述研究缺乏動(dòng)態(tài)性,考慮到成骨細(xì)胞分化的發(fā)展進(jìn)程中,蛋白質(zhì)表達(dá)為高度動(dòng)態(tài)變化過程,單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的研究難以獲得系統(tǒng)全面的蛋白變化信息。同時(shí)針對(duì)炎癥刺激作用下成骨細(xì)胞分化過程中蛋白的差異表達(dá)的研究尚未見報(bào)道。 本課題從成骨細(xì)胞正常分化及炎癥微環(huán)境下分化的生物學(xué)差異出發(fā),利用高通量的iTRAQ技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)學(xué)策略,動(dòng)態(tài)研究并篩選與炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化相關(guān)的蛋白,并對(duì)該蛋白的功能進(jìn)行驗(yàn)證,研究結(jié)果為探索炎癥微環(huán)境下成骨細(xì)胞分化機(jī)制及尋找特異性和可藥性的組合藥靶治療提供新思路和理論依據(jù)。 本論文主要包括以下四章內(nèi)容： 第一章炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化細(xì)胞模型建立及驗(yàn)證 本章實(shí)驗(yàn)主要以TNF-a作為刺激物、BMP-2誘導(dǎo)C2C12肌源細(xì)胞分化形成成骨細(xì)胞構(gòu)建炎癥刺激下的成骨細(xì)胞分化模型,通過組織化學(xué)染色檢測(cè)ALP活性和ALP熒光定量分析驗(yàn)證模型的有效性,為我們下一步蛋白組學(xué)分析奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第二章基于iTRAQ技術(shù)的炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化相關(guān)蛋白組學(xué)分析 為了更好的理解炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化機(jī)制,尋找干預(yù)炎癥微環(huán)境下成骨細(xì)胞分化的特異性和可藥性的組合藥靶,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用采用iTRAQ化學(xué)標(biāo)簽分別對(duì)炎癥刺激組和正常分化組蛋白樣品的酶解肽段進(jìn)行標(biāo)記,并進(jìn)一步對(duì)混合標(biāo)記樣品進(jìn)行多維液相色譜分離-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的技術(shù)路線篩選潛在的可能與炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化過程相關(guān)的差異蛋白。并對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物學(xué)分析,探討差異蛋白在參與炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化過程可能發(fā)揮的作用。 第三章炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化相關(guān)差異蛋白的表達(dá)驗(yàn)證 不同水平的驗(yàn)證研究可以更加完整地認(rèn)識(shí)炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化機(jī)制以及藥靶蛋白的開發(fā)。本部分研究工作采用采用基于質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring, MRM)技術(shù),Q-PCR和Western Blotting對(duì)候選蛋白ELP2和SERCA3進(jìn)一步表達(dá)驗(yàn)證,提供證據(jù)證明在其在炎癥環(huán)境下成骨細(xì)胞分化過程中具有重要作用。 第四章候選藥靶蛋白ELP2生物學(xué)作用的基本機(jī)制探討 ELP2又命名為STAT3-interacting protein1(StIP1)，調(diào)控STAT3信號(hào)通路。蛋白質(zhì)組學(xué)篩選并鑒定發(fā)現(xiàn)ELP2在正常成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào),而在炎癥刺激下表達(dá)下調(diào)。目前其對(duì)炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化的影響尚未見報(bào)道。為探討ELP2對(duì)炎癥刺激對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響,構(gòu)建靶向ELP2的SiRN進(jìn)行基因沉默,探討靶向ELP2的SiRNA對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。沉默ELP2后能夠明顯改善TNF-α對(duì)BMP-2誘導(dǎo)成骨分化的抑制。本實(shí)驗(yàn)為揭示炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化機(jī)制,尋找特異性和可藥性的藥靶蛋白提供了新的思路。 材料方法： 1.細(xì)胞株：小鼠肌源細(xì)胞株C2C12(ATCC CRL-1772)。口 2.細(xì)胞模型：細(xì)胞分為四組,加入不同刺激物繼續(xù)培養(yǎng)。1)對(duì)照組：細(xì)胞懸液中不加入任何藥品；2)BMP-2組：在細(xì)胞懸液培養(yǎng)體系中加入l00ng/ml BMP-2;3) TNF-α組：將濃度為5ng/ml的TNF-α與細(xì)胞懸液一起孵育；4)BMP-2+TNF-α組：在培養(yǎng)體系中同時(shí)加入上述濃度的BMP-2和TNF-α。 3.堿性磷酸酶(ALP)熒光活性測(cè)定及染色測(cè)定：為了比較細(xì)胞成骨分化情況,將細(xì)胞分別按5×103個(gè)/孔接種于24孔板內(nèi),細(xì)胞培養(yǎng)3天后細(xì)胞溶解,ALP活性用熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè),采用PNPP法測(cè)定堿性磷酸酶活性反映成骨細(xì)胞分化程度。波長(zhǎng)選擇405nm,酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光密度值并記錄結(jié)果。細(xì)胞培養(yǎng)7天后細(xì)胞溶解,進(jìn)行ALP染色測(cè)定(按照Alkaline Phosphatase Staining Kit操作說明進(jìn)行)。 4.基于iTRAQ技術(shù)篩選差異蛋白：細(xì)胞蛋白提取及定量后,完成iTRAQ試劑的標(biāo)記及檢測(cè),預(yù)備LC/MS/MS分析用混合樣品,經(jīng)過強(qiáng)陽(yáng)離子(SCX)交換、反相液相色譜分離后進(jìn)行ESI質(zhì)譜鑒定。對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析進(jìn)行蛋白的檢索和鑒定,完成差異蛋白的篩選。 5.差異蛋白生物學(xué)分析：對(duì)差異蛋白進(jìn)行分子功能(Molecular Function)、所處的細(xì)胞位置(Cellular Component)、參與的生物過程(Biological Process)的GO分析、COG注釋以及GO富集分析,尋找與差異蛋白質(zhì)顯著相關(guān)的生物學(xué)功能。完成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析,并通過Pathway顯著性富集能確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 6.炎癥刺激成骨細(xì)胞分化過程中差異蛋白篩選：依據(jù)模式識(shí)別和數(shù)據(jù)挖掘的聚類分析以及總體差異蛋白的交集處理,篩選參與炎癥影響成骨細(xì)胞分化過程中的差異蛋白。 7.MRM：目標(biāo)蛋白Transition篩選后基于MRM+EPI模式對(duì)transition的色譜峰進(jìn)行驗(yàn)證,過MRM檢測(cè)目標(biāo)蛋白子離子的峰強(qiáng)度,整合計(jì)算離子峰面積的大小,從而可以比較目標(biāo)蛋白在不同樣本中的表達(dá)差異。 8. Western Blotting:抽提細(xì)胞總蛋白,采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定,10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、顯影及定影。 9. RT-PCR:抽提細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用sybgreen法完成PCR擴(kuò)增。以2-ΔΔCt值代表基因的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量。 10. siRNA靶序列的設(shè)計(jì)合成及轉(zhuǎn)染：根據(jù)靶基因ELP2mRNA序列設(shè)計(jì)并合成3對(duì)得分最高的靶向ELP2基因的siRNA。C2C12細(xì)胞于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,37℃,5%CO2的溫箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天用不加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)30%～50%時(shí)采用脂質(zhì)體法將化學(xué)合成siRNA轉(zhuǎn)入C2C12細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。 11.統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。多組均數(shù)比較采用單向方差分析,多重比較方差齊性時(shí)采用LSD法,方差不齊時(shí)采用Dunnett'sT3法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果 1.炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化細(xì)胞模型建立及驗(yàn)證：?jiǎn)为?dú)或聯(lián)合應(yīng)用BMP-2與TNF-α成骨細(xì)胞的成骨活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=134.18,P=0.00)。與對(duì)照組相比,單獨(dú)應(yīng)用BMP-2可顯著增加成骨細(xì)胞的成骨活性(P=0.01)；與BMP-2組相比,TNF-α可顯著降低成骨細(xì)胞的成骨活性(P=0.00)；聯(lián)合應(yīng)用BMP-2和TNF-α與單獨(dú)應(yīng)用BMP2相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01),聯(lián)合應(yīng)用BMP-2和TNF-α與單獨(dú)應(yīng)用TNF-α相比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)。結(jié)果顯示TNF-α可顯著抑制BMP-2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化。 2. ITRAQ試劑標(biāo)記四組C2C12肌原細(xì)胞(Control, BMP-2, TNF-α, BMP-2+TNF-α) LC MS/MS鑒定分析出365,226個(gè)質(zhì)譜,其中得到21,807個(gè)肽段以及4,822個(gè)差異蛋白點(diǎn)。其中最終達(dá)到嚴(yán)格定量標(biāo)準(zhǔn)(比值≥1.5或≤0.6)的差異蛋白點(diǎn)：正常組與分化組(a_N_113-VS-b_B_114)22個(gè),分化組中上調(diào)7個(gè),下調(diào)15個(gè)；對(duì)照組與炎癥組(a_N_113-VS-c_T_115)33個(gè),炎癥組中上調(diào)25個(gè),下調(diào)8個(gè)；分化組與分化炎癥組(b_B_114-VS-d_BT_118)71個(gè),分化炎癥組中上56個(gè),下調(diào)15個(gè)。最終交集處理篩選得到5個(gè)炎癥刺激成骨細(xì)胞分化過程中的差異蛋白,即S100-A4, ATPase inhibitor (mitochondrial), Cytochrome b5, SERCA3和ELP2。其中S100-A4, ATPase inhibitor (mitochondrial), Cytochrome b5和ELP2在正常分化過程中下調(diào)而在炎癥刺激的分化過程中上調(diào)；SERCA3在正常分化過程中上調(diào)而在炎癥刺激的分化過程中下調(diào)。 3.炎癥刺激下成骨細(xì)胞分化相關(guān)差異蛋白的表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果：采用MRM技術(shù)、Western Blotting以及RT-PCR對(duì)進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證,結(jié)果顯示ELP2在正常成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào),而在炎癥刺激下表達(dá)下調(diào)；SERCA3在正常成骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)下調(diào),而在炎癥刺激下表達(dá)上調(diào)。其中RT-PCR結(jié)果顯示單獨(dú)應(yīng)用BMP-2或BMP-2聯(lián)合應(yīng)用TNF-α后ELP2的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=94.33,P=0.00)。與對(duì)照組相比,單獨(dú)應(yīng)用BMP-2可顯著降低ELP2的表達(dá)量(P=0.00)；與BMP-2組相比,BMP-2聯(lián)合應(yīng)用TNF-a后ELP2的表達(dá)量顯著升高(P=0.00)。同樣,單獨(dú)應(yīng)用BMP-2或BMP-2聯(lián)合應(yīng)用TNF-a后ATP2A3的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=88.54,P0.00)。與對(duì)照組相比,單獨(dú)應(yīng)用BMP-2可顯著升高ATP2A3的表達(dá)量(P=0.00)；與BMP-2組相比,BMP-2聯(lián)合應(yīng)用TNF-a后ATP2A3的表達(dá)量顯著降低(P=0.00)。表達(dá)驗(yàn)證的總體結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。 4.靶向ELP2的SiRNA對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響：設(shè)計(jì)合成ELP2siRNA靶序列,將3對(duì)靶向ELP2的siRNA以及陰性對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染正常C2Cl2細(xì)胞,Western Blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染后ELP2蛋白水平的改變。與對(duì)照組相比,在正常C2Cl2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Si-ELP2-1干擾序列的ELP2siRNA后,ELP2在蛋白水平的表達(dá)量顯著降低。ALP熒光活性定量分析可見,轉(zhuǎn)染siRNA-NC或ELP2siRNA后成骨細(xì)胞的成骨活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=33922.40,P=0.00)。經(jīng)多重比較顯示：與對(duì)照組相比,單獨(dú)應(yīng)用BMP-2可顯著增加成骨細(xì)胞的成骨活性(P=0.00)；與BMP-2組相比,聯(lián)合應(yīng)用TNF-a及siRNA-NC后可顯著降低成骨細(xì)胞的成骨活性(P=0.00), ALP活性由9.4倍降至2.8倍；與聯(lián)合應(yīng)用TNF-a及siRNA-NC組相比,聯(lián)合應(yīng)用TNF-a及ELP2siRNA后可顯著增強(qiáng)成骨細(xì)胞的成骨活性(P=0.00),轉(zhuǎn)染ELP2siRNA能夠顯著對(duì)抗TNF-a抑制BMP-2-誘導(dǎo)的ALP活性,ALP活性恢復(fù)至5.7倍。 結(jié)論 1. TNF-a作為刺激物、BMP-2誘導(dǎo)C2Cl2肌源細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的炎癥刺激 下成骨細(xì)胞分化模型經(jīng)驗(yàn)證有效。 2.篩選得到5個(gè)炎癥刺激成骨細(xì)胞分化過程中差異蛋白,即S100-A4,ATPase inhibitor (mitochondrial), Cytochrome b5, SERCA3和ELP2。其中S100-A4,ATPase inhibitor (mitochondrial), Cytochrome b5和ELP2在正常分化中上調(diào),而在炎癥刺激分化中下調(diào)；SERCA3在正常分化中下調(diào),而在炎癥刺激分化中表達(dá)上調(diào)。 3. MRM, Western Blotting以及RT-PCR驗(yàn)證ELP2與SERCA3的表達(dá)趨勢(shì)與iTRAQ鑒定結(jié)果一致。 4.沉默ELP2表達(dá)可以改善炎癥刺激對(duì)成骨細(xì)胞分化的抑制。ELP2可以作為一個(gè)理想的藥物靶點(diǎn)改善炎癥相關(guān)性成骨分化抑制疾病。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 LI WenWen;WANG QuanHui;CHEN JianJun;ZHOU Jian;ZHOU XinYu;XIE Peng;;A multiple-reaction-monitoring mass spectrometric method for simultaneous quantitative analysis of five plasma apolipoproteins[J];Science China(Chemistry);2014年05期

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本文編號(hào)：2674448