【摘要】：背景與目的 炎癥影響成骨分化研究現(xiàn)狀 我國每年骨折患者約有5000萬人,其中骨不連的發(fā)病率約為2%～5%。臨床大部分骨不連由開放性骨折感染導致,其產(chǎn)生的疼痛、肢體功能和心理障礙等給患者帶來極大痛苦,同時也增加患者和社會的經(jīng)濟負擔,因此針對骨不連的機制研究成為目前的熱點。骨形成過程為成骨細胞活性與破骨細胞活性相互拮抗制約、矛盾統(tǒng)一的平衡過程,其中成骨細胞由間充質(zhì)干細胞(MSC)分化而來,主要合成骨基質(zhì)；破骨細胞由骨髓單核巨噬細胞分化演變而成,主要降解骨基質(zhì)。骨折愈合過程需要大量新生成骨細胞,進而加快骨質(zhì)合成與鈣化,增加骨體積與密度。目前對于慢性持續(xù)性炎癥刺激可以促進骨吸收的相關研究已較為成熟,但慢性持續(xù)性炎癥刺激在骨形成過程中對成骨細胞分化的影響,尤其對MSC分化為成骨細胞的影響至今卻所知甚少。盡管學者們不斷探索,然而到目前為止,炎癥微環(huán)境下成骨細胞分化的調(diào)控機制仍尚未完全了解。 作為機體的一種防御反應,正常生理性炎癥反應有利于骨折愈合。但由于感染或其它因素等引起的長期慢性炎癥反應則對骨折愈合則毫無益處。目前研究已證實類風濕性關節(jié)炎、雌激素缺乏或者老化等患者血液中腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)的表達量均有所提高。作為體內(nèi)最重要的促炎性細胞因子之一,TNF-α除參與介導免疫應答外,還通過誘導局部炎癥反應和調(diào)節(jié)外周組織細胞的增殖、分化、凋亡和功能活性影響組織器官的發(fā)育和功能。而TNF-α對成骨細胞功能的調(diào)節(jié)則表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)TNF-α直接抑制成骨細胞的分化成熟及成骨；(2) TNF-α刺激成骨細胞分泌破骨性調(diào)節(jié)因子進而促進骨吸收；(3) TNF-α誘導成骨細胞凋亡、減少其數(shù)目從而抑制骨形成；(4) TNF-α影響其他促分化細胞因子或生長因子對成骨細胞的調(diào)節(jié)作用。體外實驗目前已證實TNF-α可抑制成骨細胞關鍵的轉(zhuǎn)錄因子如Runx2和Osterix因子的表達。其中TNF-α對Runx2的抑制作用主要通過造成Runx2mRNA的失穩(wěn)定進而影響細胞凋亡；并且TNF-α還通過對成骨細胞內(nèi)的Smurfl和Smurf2因子的增量調(diào)節(jié)來促進Runx2的降解。而TNF-α對Osterix抑制則通過獨立的機制,即通過包括MAPK,神經(jīng)酰胺和氧自由基等信號傳導通路間接抑制Osterix活性,進而抑制成骨細胞分化。盡管如此,TNF-α抑制成骨細胞的機制復雜仍不甚清楚。因此探索炎癥刺激影響成骨細胞分化的機制,尋找潛在的理想藥靶阻止炎癥因子對骨再生的抑制,一直是該研究領域密切關注并亟待解決的問題。 蛋白質(zhì)組學在成骨分化研究方面的研究 炎癥刺激作用下成骨細胞分化的過程存在復雜精密的調(diào)節(jié)體系,涉及諸多信號通路的調(diào)控�？紤]到信號通路之間存在的交談(cross talk)作用,加之既往研究多通過某一條或某幾條通路入手,因此難以全面地解釋成骨細胞在炎癥刺激作用下的分化過程。同時前期的研究多數(shù)通過單個靶點阻斷單一信號通路干預炎癥對成骨細胞分化的抑制。而多靶點組成的靶場干預應該是阻止炎癥因子對骨再生抑制的發(fā)展方向。只有通過對炎癥刺激影響成骨細胞分化的機制深入了解,發(fā)現(xiàn)潛在的特異性和可藥性靶標,才能做到有的放矢,針對組合靶標開發(fā)新的促進炎癥刺激下成骨細胞分化的藥物。 后基因組時代,蛋白質(zhì)作為生物功能的執(zhí)行者已經(jīng)成為生命科學領域的研究熱點。蛋白質(zhì)組學是對機體、組織或細胞的全部蛋白質(zhì)的表達水平、蛋白修飾與功能、蛋白之間的相互作用等進行高通量的篩選和分析,比傳統(tǒng)的單個基因研究或單個蛋白研究更能增加疾病診斷、預后判斷的可靠性,更能夠準確反映機體的狀態(tài)。如果運用傳統(tǒng)的生化技術手段一個個地去研究這些蛋白質(zhì),工作量非常巨大,幾乎不可能完成,而找到一些新的發(fā)病機理就顯得更加困難。因此作為一種全新的系統(tǒng)生物學研究方法,蛋白質(zhì)組學技術為揭示炎癥影響成骨細胞分化的機制提供了強有力的幫助。目前在成骨細胞的研究方面,蛋白質(zhì)組學分析主要集中于兩類內(nèi)容：1)間充質(zhì)干細胞定向成骨細胞分化的蛋白質(zhì)組學分析,找到差異表達的蛋白并進行機制探索；2)利用試驗動物,研究各種生物及機械刺激對成骨細胞的形成以探討成骨細胞的各種反應機制。以上成骨細胞的蛋白質(zhì)組學研究取得了很多進展與突破,初步揭示了成骨細胞形成的部分分子機制,發(fā)現(xiàn)了一些與成骨細胞分化的相關蛋白。但上述研究缺乏動態(tài)性,考慮到成骨細胞分化的發(fā)展進程中,蛋白質(zhì)表達為高度動態(tài)變化過程,單個時間點的研究難以獲得系統(tǒng)全面的蛋白變化信息。同時針對炎癥刺激作用下成骨細胞分化過程中蛋白的差異表達的研究尚未見報道。 本課題從成骨細胞正常分化及炎癥微環(huán)境下分化的生物學差異出發(fā),利用高通量的iTRAQ技術聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)學策略,動態(tài)研究并篩選與炎癥刺激下成骨細胞分化相關的蛋白,并對該蛋白的功能進行驗證,研究結(jié)果為探索炎癥微環(huán)境下成骨細胞分化機制及尋找特異性和可藥性的組合藥靶治療提供新思路和理論依據(jù)。 本論文主要包括以下四章內(nèi)容： 第一章炎癥刺激下成骨細胞分化細胞模型建立及驗證 本章實驗主要以TNF-a作為刺激物、BMP-2誘導C2C12肌源細胞分化形成成骨細胞構建炎癥刺激下的成骨細胞分化模型,通過組織化學染色檢測ALP活性和ALP熒光定量分析驗證模型的有效性,為我們下一步蛋白組學分析奠定實驗基礎。 第二章基于iTRAQ技術的炎癥刺激下成骨細胞分化相關蛋白組學分析 為了更好的理解炎癥刺激下成骨細胞分化機制,尋找干預炎癥微環(huán)境下成骨細胞分化的特異性和可藥性的組合藥靶,本實驗運用采用iTRAQ化學標簽分別對炎癥刺激組和正常分化組蛋白樣品的酶解肽段進行標記,并進一步對混合標記樣品進行多維液相色譜分離-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定的技術路線篩選潛在的可能與炎癥刺激下成骨細胞分化過程相關的差異蛋白。并對差異蛋白進行生物學分析,探討差異蛋白在參與炎癥刺激下成骨細胞分化過程可能發(fā)揮的作用。 第三章炎癥刺激下成骨細胞分化相關差異蛋白的表達驗證 不同水平的驗證研究可以更加完整地認識炎癥刺激下成骨細胞分化機制以及藥靶蛋白的開發(fā)。本部分研究工作采用采用基于質(zhì)譜的多反應監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring, MRM)技術,Q-PCR和Western Blotting對候選蛋白ELP2和SERCA3進一步表達驗證,提供證據(jù)證明在其在炎癥環(huán)境下成骨細胞分化過程中具有重要作用。 第四章候選藥靶蛋白ELP2生物學作用的基本機制探討 ELP2又命名為STAT3-interacting protein1(StIP1)，調(diào)控STAT3信號通路。蛋白質(zhì)組學篩選并鑒定發(fā)現(xiàn)ELP2在正常成骨細胞分化過程中表達上調(diào),而在炎癥刺激下表達下調(diào)。目前其對炎癥刺激下成骨細胞分化的影響尚未見報道。為探討ELP2對炎癥刺激對成骨細胞分化的影響,構建靶向ELP2的SiRN進行基因沉默,探討靶向ELP2的SiRNA對成骨細胞分化的影響。沉默ELP2后能夠明顯改善TNF-α對BMP-2誘導成骨分化的抑制。本實驗為揭示炎癥刺激下成骨細胞分化機制,尋找特異性和可藥性的藥靶蛋白提供了新的思路。 材料方法： 1.細胞株：小鼠肌源細胞株C2C12(ATCC CRL-1772)。口 2.細胞模型：細胞分為四組,加入不同刺激物繼續(xù)培養(yǎng)。1)對照組：細胞懸液中不加入任何藥品；2)BMP-2組：在細胞懸液培養(yǎng)體系中加入l00ng/ml BMP-2;3) TNF-α組：將濃度為5ng/ml的TNF-α與細胞懸液一起孵育；4)BMP-2+TNF-α組：在培養(yǎng)體系中同時加入上述濃度的BMP-2和TNF-α。 3.堿性磷酸酶(ALP)熒光活性測定及染色測定：為了比較細胞成骨分化情況,將細胞分別按5×103個/孔接種于24孔板內(nèi),細胞培養(yǎng)3天后細胞溶解,ALP活性用熒光檢測試劑盒檢測,采用PNPP法測定堿性磷酸酶活性反映成骨細胞分化程度。波長選擇405nm,酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光密度值并記錄結(jié)果。細胞培養(yǎng)7天后細胞溶解,進行ALP染色測定(按照Alkaline Phosphatase Staining Kit操作說明進行)。 4.基于iTRAQ技術篩選差異蛋白：細胞蛋白提取及定量后,完成iTRAQ試劑的標記及檢測,預備LC/MS/MS分析用混合樣品,經(jīng)過強陽離子(SCX)交換、反相液相色譜分離后進行ESI質(zhì)譜鑒定。對質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析進行蛋白的檢索和鑒定,完成差異蛋白的篩選。 5.差異蛋白生物學分析：對差異蛋白進行分子功能(Molecular Function)、所處的細胞位置(Cellular Component)、參與的生物過程(Biological Process)的GO分析、COG注釋以及GO富集分析,尋找與差異蛋白質(zhì)顯著相關的生物學功能。完成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析,并通過Pathway顯著性富集能確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。 6.炎癥刺激成骨細胞分化過程中差異蛋白篩選：依據(jù)模式識別和數(shù)據(jù)挖掘的聚類分析以及總體差異蛋白的交集處理,篩選參與炎癥影響成骨細胞分化過程中的差異蛋白。 7.MRM：目標蛋白Transition篩選后基于MRM+EPI模式對transition的色譜峰進行驗證,過MRM檢測目標蛋白子離子的峰強度,整合計算離子峰面積的大小,從而可以比較目標蛋白在不同樣本中的表達差異。 8. Western Blotting:抽提細胞總蛋白,采用BCA法進行蛋白濃度測定,10%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫雜交、顯影及定影。 9. RT-PCR:抽提細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用sybgreen法完成PCR擴增。以2-ΔΔCt值代表基因的相對表達強度進行相對定量。 10. siRNA靶序列的設計合成及轉(zhuǎn)染：根據(jù)靶基因ELP2mRNA序列設計并合成3對得分最高的靶向ELP2基因的siRNA。C2C12細胞于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液,37℃,5%CO2的溫箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天用不加抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng),當細胞匯合度達30%～50%時采用脂質(zhì)體法將化學合成siRNA轉(zhuǎn)入C2C12細胞,倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。 11.統(tǒng)計分析：采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理。多組均數(shù)比較采用單向方差分析,多重比較方差齊性時采用LSD法,方差不齊時采用Dunnett'sT3法。檢驗水準α=0.05。 結(jié)果 1.炎癥刺激下成骨細胞分化細胞模型建立及驗證：單獨或聯(lián)合應用BMP-2與TNF-α成骨細胞的成骨活性差異有統(tǒng)計學意義(F=134.18,P=0.00)。與對照組相比,單獨應用BMP-2可顯著增加成骨細胞的成骨活性(P=0.01)；與BMP-2組相比,TNF-α可顯著降低成骨細胞的成骨活性(P=0.00)；聯(lián)合應用BMP-2和TNF-α與單獨應用BMP2相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.01),聯(lián)合應用BMP-2和TNF-α與單獨應用TNF-α相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.02)。結(jié)果顯示TNF-α可顯著抑制BMP-2誘導的成骨細胞分化。 2. ITRAQ試劑標記四組C2C12肌原細胞(Control, BMP-2, TNF-α, BMP-2+TNF-α) LC MS/MS鑒定分析出365,226個質(zhì)譜,其中得到21,807個肽段以及4,822個差異蛋白點。其中最終達到嚴格定量標準(比值≥1.5或≤0.6)的差異蛋白點：正常組與分化組(a_N_113-VS-b_B_114)22個,分化組中上調(diào)7個,下調(diào)15個；對照組與炎癥組(a_N_113-VS-c_T_115)33個,炎癥組中上調(diào)25個,下調(diào)8個；分化組與分化炎癥組(b_B_114-VS-d_BT_118)71個,分化炎癥組中上56個,下調(diào)15個。最終交集處理篩選得到5個炎癥刺激成骨細胞分化過程中的差異蛋白,即S100-A4, ATPase inhibitor (mitochondrial), Cytochrome b5, SERCA3和ELP2。其中S100-A4, ATPase inhibitor (mitochondrial), Cytochrome b5和ELP2在正常分化過程中下調(diào)而在炎癥刺激的分化過程中上調(diào)；SERCA3在正常分化過程中上調(diào)而在炎癥刺激的分化過程中下調(diào)。 3.炎癥刺激下成骨細胞分化相關差異蛋白的表達驗證結(jié)果：采用MRM技術、Western Blotting以及RT-PCR對進行表達驗證,結(jié)果顯示ELP2在正常成骨細胞分化過程中表達上調(diào),而在炎癥刺激下表達下調(diào)；SERCA3在正常成骨細胞分化過程中表達下調(diào),而在炎癥刺激下表達上調(diào)。其中RT-PCR結(jié)果顯示單獨應用BMP-2或BMP-2聯(lián)合應用TNF-α后ELP2的表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=94.33,P=0.00)。與對照組相比,單獨應用BMP-2可顯著降低ELP2的表達量(P=0.00)；與BMP-2組相比,BMP-2聯(lián)合應用TNF-a后ELP2的表達量顯著升高(P=0.00)。同樣,單獨應用BMP-2或BMP-2聯(lián)合應用TNF-a后ATP2A3的表達量差異有統(tǒng)計學意義(F=88.54,P0.00)。與對照組相比,單獨應用BMP-2可顯著升高ATP2A3的表達量(P=0.00)；與BMP-2組相比,BMP-2聯(lián)合應用TNF-a后ATP2A3的表達量顯著降低(P=0.00)。表達驗證的總體結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。 4.靶向ELP2的SiRNA對成骨細胞分化的影響：設計合成ELP2siRNA靶序列,將3對靶向ELP2的siRNA以及陰性對照siRNA分別轉(zhuǎn)染正常C2Cl2細胞,Western Blotting檢測轉(zhuǎn)染后ELP2蛋白水平的改變。與對照組相比,在正常C2Cl2細胞中轉(zhuǎn)染Si-ELP2-1干擾序列的ELP2siRNA后,ELP2在蛋白水平的表達量顯著降低。ALP熒光活性定量分析可見,轉(zhuǎn)染siRNA-NC或ELP2siRNA后成骨細胞的成骨活性差異有統(tǒng)計學意義(F=33922.40,P=0.00)。經(jīng)多重比較顯示：與對照組相比,單獨應用BMP-2可顯著增加成骨細胞的成骨活性(P=0.00)；與BMP-2組相比,聯(lián)合應用TNF-a及siRNA-NC后可顯著降低成骨細胞的成骨活性(P=0.00), ALP活性由9.4倍降至2.8倍；與聯(lián)合應用TNF-a及siRNA-NC組相比,聯(lián)合應用TNF-a及ELP2siRNA后可顯著增強成骨細胞的成骨活性(P=0.00),轉(zhuǎn)染ELP2siRNA能夠顯著對抗TNF-a抑制BMP-2-誘導的ALP活性,ALP活性恢復至5.7倍。 結(jié)論 1. TNF-a作為刺激物、BMP-2誘導C2Cl2肌源細胞分化為成骨細胞的炎癥刺激 下成骨細胞分化模型經(jīng)驗證有效。 2.篩選得到5個炎癥刺激成骨細胞分化過程中差異蛋白,即S100-A4,ATPase inhibitor (mitochondrial), Cytochrome b5, SERCA3和ELP2。其中S100-A4,ATPase inhibitor (mitochondrial), Cytochrome b5和ELP2在正常分化中上調(diào),而在炎癥刺激分化中下調(diào)；SERCA3在正常分化中下調(diào),而在炎癥刺激分化中表達上調(diào)。 3. MRM, Western Blotting以及RT-PCR驗證ELP2與SERCA3的表達趨勢與iTRAQ鑒定結(jié)果一致。 4.沉默ELP2表達可以改善炎癥刺激對成骨細胞分化的抑制。ELP2可以作為一個理想的藥物靶點改善炎癥相關性成骨分化抑制疾病。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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1 LI WenWen;WANG QuanHui;CHEN JianJun;ZHOU Jian;ZHOU XinYu;XIE Peng;;A multiple-reaction-monitoring mass spectrometric method for simultaneous quantitative analysis of five plasma apolipoproteins[J];Science China(Chemistry);2014年05期

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本文編號：2674448