【摘要】：目的:HIV-1感染機體導致的潛伏感染是艾滋病(AIDS)無法治愈的主要原因之一,如何有效激活HIV-1潛伏病毒進而清除,是治愈AIDS的關鍵措施。其中HIV-1病毒潛伏庫形成和維持的主要因素與HIV-1 5'LTR中CpG甲基化相關。APOBEC3A(A3A)是載脂蛋白B m RNA編輯酶催化亞基3(APOBEC3)家族成員之一,目前已經(jīng)證實A3A能夠識別甲基化胞嘧啶(methylcytosine,mC),參與DNA甲基化修飾的調(diào)節(jié)。A3A可以有效地激活HIV-1潛伏病毒,推測與A3A具有甲基化胞嘧啶脫氨酶活性有關,借助甲基化胞嘧啶脫氨酶活性催化5'LTR中的甲基化CpG去甲基化。為明確A3A對HIV-1啟動子5'LTR上CpG島甲基化的調(diào)節(jié)作用,通過構建并修飾攜帶有HIV-1啟動子的甲基化載體,構建并篩選A3A異構體a(A3A Isotype a,A3A-a)和A3A異構體b(A3A Isotype b,A3A-b)高表達真核載體,分析A3A去甲基化功能,并探索其分子機制,為新型HIV病毒激活劑的研發(fā)奠定基礎。方法:1.構建攜帶有HIV-1啟動子5'LTR序列的載體p LTR-Luc2P-EGFP,CpG甲基化酶M.Sss I處理載體p LTR-Luc2P-EGFP,得到甲基化指示載體pmeLTR-Luc2P-EGFP,用亞硫酸氫鹽修飾PCR測序和甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶酶切對甲基化載體進一步鑒定。2.HIV-1的5'LTR序列含有八個Cp G島,易被甲基化,載體pmeLTR-Luc2P-EGFP的甲基化位點位于載體啟動子區(qū)域,并攜帶Luc2P和EGFP兩個指示標志,因此分別用三種方法檢測甲基化水平:(1)蛋白印跡(Western Blotting,WB)方法檢測EGFP的表達,(2)熒光素酶方法檢測相對熒光素酶活性和相對熒光素酶比值,(3)Real-Time PCR方法進行Hpa II敏感性分析。分別轉染甲基化質(zhì)粒pmeLTR-Luc2P-EGFP和未甲基化質(zhì)粒pLTR-Luc2P-EGFP,驗證初步選取的三種甲基化檢測方法可行;轉染不同甲基化程度(100%、75%、50%、25%、0%)的質(zhì)粒,驗證三種甲基化檢測方法能檢測不同的甲基化梯度,結果進行Pearson相關性分析,將0%、25%、50%、75%、100%設定為相應甲基化程度(100%、75%、50%、25%、0%)的標準值,對三種方法的測得值和標準值之間的相關性進行評價。3.從THP-1細胞mRNA中擴增得到A3A-a和A3A-b的cDNA,分別克隆至真核表達載體pASIB-HA和pCAGGS-HA。轉染HEK-293T細胞,蛋白印跡檢測A3A-a和A3A-b的蛋白表達,并篩選出A3A-a和A3A-b的高表達載體。4.將A3A-a、A3A-b高表達載體和陰性對照載體pASIB-HA-A3G與甲基化載體pmeLTR-Luc2P-EGFP分別共轉染HEK-293T,在細胞水平中,WB方法檢測指示蛋白EGFP表達和熒光素酶方法檢測相對熒光素酶活性,評價A3A-a和A3A-b的去甲基化調(diào)節(jié)作用。5.將A3A-a高表達載體轉染HEK-293T細胞,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)檢測A3A和胸腺嘧啶糖苷酶(Thymine DNA glycosylase,TDG)的相互作用,研究A3A去甲基化分子機制。結果:1.經(jīng)雙酶切和測序鑒定攜帶有HIV-1啟動子5'LTR序列的載體p LTR-Luc2P-EGFP成功構建;CpG甲基化酶M.Sss I處理,成功得到甲基化指示載體pmeLTR-Luc2P-EGFP;經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾PCR測序和甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定,證實甲基化處理有效。2.用WB、熒光素酶和Real-Time PCR方法檢測甲基化水平。與未甲基化質(zhì)粒p LTR-Luc2P-EGFP轉染組相比發(fā)現(xiàn),甲基化指示載體pmeLTR-Luc2P-EGFP轉染組:(1)EGFP蛋白表達水平明顯減弱;(2)相對熒光素酶活性明顯減弱;(3)Hpa II的敏感性明顯減弱。這些結果證實,甲基化指示載體pmeLTR-Luc2P-EGFP的甲基化處理有效,并驗證了上述三種方法可以用于甲基化檢測。通過轉染不同甲基化程度的質(zhì)粒,隨著甲基化程度的減弱:(1)EGFP蛋白表達水平逐漸增高;(2)相對熒光素酶活性和相對熒光素酶比值逐漸增強;(3)Hpa II的敏感性逐漸增高;Pearson相關性分析,結果顯示上述三種方法的測得值和標準值之間均呈較強正相關,Real-Time PCR方法相關性最好,WB方法次之,熒光素酶方法相對較低;這些結果驗證了三種方法可以用于檢測不同程度的甲基化水平。3.PCR、酶切鑒定和測序結果均表明A3A真核表達載體pASIB-HA-A3A1-a/b、pCAGGS-HA-A3A2-a/b構建成功。經(jīng)過WB篩選,pCAGGS-HA-A3A3-a和pCAGGS-HA-A3A3-b中A3A蛋白表達量較高,并用于后續(xù)實驗。4.甲基化載體共轉染結果顯示,相較于對照A3G轉染組,A3A-a和A3A-b組中EGFP的表達量明顯上調(diào),相對熒光素酶活性明顯增強。5.Co-IP結果顯示,在A3A和TDG蛋白位置處有明顯條帶,提示A3A與TDG蛋白存在相互作用。結論:1.在細胞水平上證實A3A分子異構體a和異構體b均可識別DNA中5-甲基胞嘧啶,催化HIV-1啟動子CpG島去甲基化,為進一步研究A3A對HIV潛伏感染調(diào)控奠定基礎。2.A3A與TDG存在相互作用,提示A3A可能通過TDG依賴的活性DNA去甲基化途徑參與5-甲基胞嘧啶去甲基化。
【圖文】：

PCR擴增產(chǎn)物LTRFigure1-1PCRamplificationproductsofLTRM：DNAmarkerDL2000；1，，2：PCR產(chǎn)物LTR

14圖 1-2 pLTR-EGFP 真核表達質(zhì)粒酶切凝膠電泳結果Figure 1-2 Restriction digestion of eukaryotic expression vector pLTR-EGFPM：DNAmarker DL2000；1：Ase I 和 Nhe I 雙酶切質(zhì)粒 pLTR-EGFPM：DNAmarker DL15000；1，2：Ase I、Nhe I、Bgl II 酶切質(zhì)粒 pLTR-EGFP
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R373

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