【摘要】：研究目的和意義構(gòu)建中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)受體結(jié)合區(qū)(RBD)特異性納米抗體噬菌體文庫,通過噬菌體展示技術(shù)篩選出RBD特異性納米抗體分子。對(duì)篩選的特異性納米抗體分子進(jìn)行不同表達(dá)形式的設(shè)計(jì),比較不同表達(dá)形式納米抗體分子的生物學(xué)活性與功能差異,并對(duì)篩選出的納米抗體分子進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià),為開發(fā)有效的抗MERS-CoV納米抗體藥物奠定研究基礎(chǔ)。研究方法使用MERS-CoV RBD重組蛋白免疫羊駝,采集免疫后羊駝外周血并分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)提取總RNA。使用簡并引物通過PCR擴(kuò)增重鏈抗體的重鏈可變區(qū)(VHH)基因片段并連接p CANTAB5e載體將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)大腸桿菌株,構(gòu)建特異性納米抗體噬菌體文庫。以RBD重組蛋白為抗原,通過噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行納米抗體分子的篩選。對(duì)篩選出的納米抗體分子Nano10進(jìn)行不同形式的設(shè)計(jì)與表達(dá):將Nano10片段與人IgG1 Fc片段進(jìn)行融合表達(dá),以期形成二聚體結(jié)構(gòu)的納米抗體分子10-Fc;將不同拷貝的Nano10分子通過柔性linker串聯(lián)形成二聯(lián)體和三聯(lián)體抗體分子。利用畢赤酵母對(duì)不同表達(dá)形式的納米抗體進(jìn)行重組表達(dá),并利用抗體分子攜帶的組氨酸標(biāo)簽或Fc分子進(jìn)行純化,獲得4種不同形式的納米抗體:Nano10單體分子(10-his)、Nano10與Fc融合蛋白(10-Fc)、Nano10二聯(lián)體分子(10-2)和三聯(lián)體分子(10-3)。通過間接ELISA和表面等離子共振(SPR)技術(shù)檢測4種形式的納米抗體與MERS-CoV抗原的反應(yīng)性和親和力;通過假病毒與活病毒中和試驗(yàn),驗(yàn)證不同改造形式的納米抗體的體外中和活性;通過流式細(xì)胞術(shù)檢測抗體分子阻斷MERS-CoV RBD分子與細(xì)胞表面病毒受體分子結(jié)合的效果,明確抗體發(fā)揮中和作用的方式;利用MERS-CoV敏感小鼠模型(hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠)進(jìn)行體內(nèi)保護(hù)效果評(píng)價(jià),篩選出具有良好體內(nèi)外活性的候選納米抗體分子。對(duì)篩選出的抗體分子進(jìn)一步進(jìn)行功能研究。(1)采用對(duì)MERS-CoV RBD抗原進(jìn)行定點(diǎn)突變,解析候選抗體分子識(shí)別的關(guān)鍵中和位點(diǎn),分析抗體改造對(duì)識(shí)別位點(diǎn)的影響。(2)利用符合不同年代不同地區(qū)MERS-CoV分離株RBD序列特征的MERS-CoV假病毒進(jìn)行抗體中和試驗(yàn),反映候選納米抗體分子對(duì)MERS-CoV不同時(shí)期和地區(qū)毒株的交叉中和活性。(3)將納米抗體在不同的溫度條件下放置不同時(shí)間后,通過病毒中和試驗(yàn)、流式細(xì)胞受體結(jié)合與阻斷試驗(yàn)來評(píng)價(jià)候選納米抗體分子的耐熱穩(wěn)定性。(4)通過檢測注射納米抗體后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中納米抗體殘留情況,分析候選納米抗體體內(nèi)代謝特征和抗體穩(wěn)定性。(5)利用MERS-CoV感染致死模型,評(píng)價(jià)候選納米抗體在預(yù)防和治療中的體內(nèi)保護(hù)作用。研究結(jié)果本研究構(gòu)建了MERS-CoV RBD特異性納米抗體噬菌體文庫,并利用RBD重組蛋白篩選到具有較高親和力的納米抗體分子Nano10。設(shè)計(jì)了4種不同表達(dá)形式的納米抗體分子(10-his、10-Fc、10-2、10-3),利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功制備并純化了4種納米抗體分子。ELISA結(jié)果表明,4種形式的納米抗體分子與MERS-CoV重組抗原均具有良好的結(jié)合活性;通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)分析納米抗體分子親和力,結(jié)果表明經(jīng)過改造后的納米抗體分子具有更好的抗原親和力。4種形式的納米抗體分子均具有良好的體外抗病毒中和活性,流式受體結(jié)合與阻斷試驗(yàn)結(jié)果表明抗體分子能夠有效阻斷病毒RBD蛋白與細(xì)胞表面受體分子的結(jié)合,表明抗體是通過阻斷病毒RBD與細(xì)胞表面受體分子的結(jié)合來發(fā)揮中和活性的。盡管不同設(shè)計(jì)的納米抗體具有良好的體外活性,但在體內(nèi)攻毒保護(hù)性試驗(yàn)中,只有納米抗體分子10-Fc表現(xiàn)出對(duì)致死劑量攻毒的h DPP4轉(zhuǎn)基因小鼠的完全保護(hù)作用,表明將納米抗體VHH片段與人Ig G1 Fc片段融合表達(dá)形成的二聚體抗體分子具有更好的抗病毒活性。進(jìn)一步對(duì)納米抗體的中和表位解析發(fā)現(xiàn),位于病毒RBD上539位的天冬氨酸是納米抗體識(shí)別的關(guān)鍵中和位點(diǎn),納米抗體的改造未影響識(shí)別該位點(diǎn)。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),Asp539在目前MERS-CoV分離株中高度保守,利用RBD突變體假病毒進(jìn)行中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),納米抗體10-Fc對(duì)不同地區(qū)不同年代的MERS-CoV假病毒均具有良好的中和活性,表明候選納米抗體對(duì)不同MERS-CoV毒株具有交叉中和活性。體外實(shí)驗(yàn)表明,納米抗體在60℃放置7 d仍能保持良好的中和活性;體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),納米抗體分子10-Fc體內(nèi)代謝穩(wěn)定性顯著高于單體抗體分子10-his。在體試驗(yàn)表明:MERS-CoV致死性感染前3 d、感染后1 d或3 d分別對(duì)hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射10 mg/kg納米抗體分子10-Fc,均能對(duì)hDPP4轉(zhuǎn)基因小鼠的完全保護(hù),說明納米抗體10-Fc具有良好的預(yù)防和治療作用。研究結(jié)論本研究利用建立的MERS-CoV RBD特異性納米抗體噬菌體文庫篩選得到的抗體分子進(jìn)行不同形式的改造,并利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功對(duì)候選納米抗體分子進(jìn)行表達(dá)。通過比對(duì)分析,明確了不同形式的候選納米抗體的抗原反應(yīng)性、親和力、病毒中和活性、病毒與受體結(jié)合阻斷效果、體內(nèi)保護(hù)作用。并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步明確了IgG1Fc融合形式的納米抗體分子10-Fc不僅保持了原有納米抗體VHH單體分子的表位特征,而且能有效的提高抗體的穩(wěn)定性與保護(hù)活性,更好地發(fā)揮免疫保護(hù)作用。該研究提出了有效的納米抗體分子改造與優(yōu)化策略,為進(jìn)一步發(fā)展抗MERS-CoV保護(hù)性抗體及疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

吸綜合征冠狀病毒特異性納米抗體的制備及功能研究 2015 級(jí)碩士學(xué)位庫的構(gòu)建，對(duì)構(gòu)建的 MERS-CoV RBD 特異性納米抗體噬菌體文庫，庫容為 1.31×108個(gè)；豐度為 5.65×1010個(gè)/ml；挑選 25 個(gè)隨機(jī)單插入率的鑒定，插入率達(dá)到 96%（圖 1-2）；將隨機(jī)挑選的 43 個(gè)單測序和序列分析，發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的噬菌體庫具有良好的多樣性（圖 1-3 MERS-CoV RBD 重組蛋白作為抗原，通過噬菌體展示技術(shù)進(jìn)行 4 將 4 輪淘篩后的噬菌體上清與 RBD 重組蛋白進(jìn)行抗原反應(yīng)性檢測得 RBD 特異性的納米抗體陽性克�。▓D 1-4），，選擇其中 2G9 陽性為 Nano10，進(jìn)行后續(xù)不同表達(dá)形式的設(shè)計(jì)制備與功能研究。

VHH片段插入率鑒定
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 朱泰承;李寅;;畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展概況及趨勢[J];生物工程學(xué)報(bào);2015年06期

本文編號(hào)：2672108