【摘要】：第一部分脂肪干細胞的體外分離、培養(yǎng)、純化及鑒定目的:尋求一種在體外分離、培養(yǎng)、純化及鑒定SD大鼠脂肪干細胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)的有效可行而又簡單方便的方法,并檢測其成骨分化能力,為后續(xù)的相關實驗提供可靠的細胞來源。方法:1、選取健康成年SD雄性大鼠,剪取腹部和腹股溝處皮下脂肪組織,組織塊貼壁法進行培養(yǎng)。通過體外培養(yǎng)及連續(xù)傳代的方式,對ADSCs進行擴增、純化。2、倒置相差顯微鏡觀察脂肪干細胞的形態(tài)變化。免疫熒光法鑒定脂肪干細胞膜表面抗原CD44。3、對分離培養(yǎng)出的細胞進行成骨誘導分化及茜素紅染色,觀察并鑒定脂肪干細胞的成骨分化潛能。結果:1、取材6小時即后可見脂肪干細胞散在分布、貼壁;3天后貼壁細胞粘附牢固,細胞體積變大,顆粒明顯增多,生長力旺盛,部分已呈現出集落生長;7天后細胞體變得狹長,呈梭行、渦旋狀排列。傳代細胞形態(tài)穩(wěn)定且均一。2、取第四代傳代培養(yǎng)脂肪干細胞,常規(guī)消化脫壁,用免疫熒光法檢測表面抗原CD44呈陽性表達。3、脂肪干細胞成骨誘導分化后形成質地致密的細胞團,予茜素紅染色后呈現大量橘紅色的鈣結節(jié)。結論:使用脂肪組織塊貼壁法并連續(xù)傳代法得到純化的脂肪干細胞的方法,既簡單方便,又高效。使用該方法得到的脂肪干細胞性狀穩(wěn)定、狀態(tài)良好、生長力旺盛、成骨分化潛力較大,可作為理想的種子細胞,為后續(xù)的實驗提供可靠的、穩(wěn)定的細胞來源。第二部分Wnt通路和BMP-2互反饋調節(jié)在脂肪干細胞成骨分化中的機制目的:在ADSCs成骨誘導分化過程中,觀察Wnt通路與BMP-2的表達,及其之間的相互關聯,并研究Wnt通路調控BMP-2表達,從而調節(jié)ADSCs成骨分化的作用及機制;反過來,BMP-2過表達又反饋性的調節(jié)Wnt通路活性,從而影響ADSCs成骨分化。為精確調控ADSCs分化,促進骨性關節(jié)炎愈合及創(chuàng)傷的恢復,豐富再生醫(yī)學提供理論依據。方法:1、Li Cl刺激干預體外培養(yǎng)的ADSCs,通過CCK-8法觀察ADSCs的增殖活性,通過Western blot法檢測增殖細胞核抗原(PCNA)的表達情況。2、成骨誘導分化過程中,Western blot、RT-q PCR法分別檢測ADSCs成骨分化各時期成骨指標BMP-2、RUNX2,以及Wnt通路的關鍵分子β-catenin、Wnt5a的表達情況;3、分別用Li Cl、DKK-1刺激干預ADSCs成骨誘導分化,檢測分化早期(第3天)、分化中期(第7天)、分化晚期(第14天)、分化后期(第17天)成骨指標BMP-2、RUNX2,以及Wnt通路的關鍵分子β-catenin、Wnt5a的表達情況。4、BMP-2慢病毒載體陽性轉染ADSCs后,Western blot、RT-q PCR法分別檢測ADSCs成骨分化各時期成骨指標BMP-2、RUNX2,以及Wnt通路的關鍵分子β-catenin、Wnt5a的表達情況。在成骨誘導分化后期第17天,免疫熒光法檢測RUNX2表達情況,Western blot法檢測成骨指標BMP-2、RUNX2,以及Wnt通路的關鍵分子β-catenin、Wnt5a的表達情況。結果:1、Li Cl刺激組的ADSCs增值潛力增強,且PCNA蛋白呈現高表達。2、ADSCs成骨誘導分化過程中,隨著時間的推移,成骨指標BMP-2、RUNX2的表達先增強后減弱;Wnt通路關鍵分子β-catenin的表達先增加后減少,Wnt5a表達則呈現先減少后增加的趨勢。3、成骨誘導分化早期(第3d),Li Cl促進β-catenin的表達,Wnt5a表達減弱,DKK-1抑制β-catenin的表達,Wnt5a表達增強,Li Cl組成骨相關指標BMP-2、RUNX2表達增強,DKK-1組則表達減弱。ADSCs成骨誘導分化中期(第7d)、晚期(第14d),Li Cl組成骨指標BMP-2、RUNX2表達增強,同時Wnt通路關鍵分子β-catenin的表達上調,Wnt5a的表達下調。DKK-1組結果則相反;4、ADSCs成骨誘導分化后期(第17-25d),隨著時間的推移,陰性對照組BMP-2、RUNX2表達降低,β-catenin表達下調,Wnt5a蛋白表達上調。Li Cl組BMP-2、RUNX2蛋白表達減弱,β-catenin表達上調,Wnt5a的表達下調,DKK-1組結果相反。5、對ADSCs成功轉染BMP-2慢病毒后,在ADSCs成骨誘導分化過程中(第3d、7d、14d),BMP-2慢病毒轉染組BMP-2、RUNX2的表達均增強,Wnt5a的表達下調;在ADSCs成骨誘導分化第17d,即BMP-2慢病毒過表達時期,免疫熒光法檢測RUNX2表達顯著,Western blot檢測BMP-2慢病毒轉染組的BMP-2、RUNX2蛋白表達增加,β-catenin表達上調、Wnt5a表達則下調。結論:1、Li Cl能激活Wnt通路,促進ADSCs增殖分化。2、在ADSCs成骨誘導分化中,Li Cl激活Wnt通路關鍵因子β-catenin表達,同時下調了Wnt5a的表達,在成骨誘導分化中,早期主要促進ADSCs快速增殖,上調BMP-2促進成骨誘導分化;中期、晚期繼續(xù)上調BMP-2促進成骨誘導分化;后期逐漸下調BMP-2的表達,不利于ADSCs成骨誘導分化。而DKK-1抑制組作用相反。3、BMP-2過表達反饋促進Wnt通路關鍵因子β-catenin的表達,下調了Wnt5a的表達,繼續(xù)促進成骨誘導分化。
【圖文】：

（11）吸棄 PBS，加入茜素紅染色；（12）吸棄茜素紅染色液，2ml 冷 PBS 輕柔沖洗 3 遍；（13）光學相差顯微鏡下觀察染色情況，拍照記錄。3 結果3.1 SD 大鼠脂肪干細胞的形態(tài)學性狀觀察（1）6h 后，培養(yǎng)瓶底粘貼附著大量脂肪貼壁細胞，散在分布，細胞核清晰，散在少量雜質細胞（圖 1-1）；（2)3d 后，脂肪貼壁細胞牢固粘附，生長良好，顆粒增多，，細胞體積較前增大，遮光性弱，局部呈現出集落生長（圖 1-2)；(3)7d 后，可見貼壁細胞形態(tài)基本上已經呈現出一致性，細胞體此時變得狹長，呈梭行或漩渦狀排列。清晰可見橢圓形的細胞核（圖 1-3）。

注：圖 2-1.CD44 陽性表達顯示紅色熒光圖 2-2.DAPI 復染核呈藍色圖 2-3.合成染色情況3.3 SD 大鼠脂肪干細胞成骨分化潛能鑒定給予茜素紅染色后，100 倍鏡下（圖 3-1）和 400 倍鏡下（圖 3-2)可觀察到大量橘紅色的鈣結節(jié)形成。
【學位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

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本文編號：2671375