【摘要】：背景:CD147(cluster of differentiation 147)是一個(gè)跨膜糖蛋白,高表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞,多項(xiàng)研究證實(shí)其參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,我們實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)敲低CD147的表達(dá)可顯著增強(qiáng)曲妥珠單抗對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌敏感細(xì)胞的抑制作用,提示CD147是一個(gè)有價(jià)值的治療腫瘤及自身免疫性疾病的靶點(diǎn)。目前,已有針對(duì)CD147的鼠單抗用于肝癌的靶向治療。人源抗體在體內(nèi)治療應(yīng)用中比鼠單抗更具優(yōu)越性,尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。目的:運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)篩選平臺(tái)篩選特異性人源抗CD147單鏈抗體(scFv),利用同源重組技術(shù)將scFv轉(zhuǎn)換為人源抗CD147IgG1抗體,并鑒定其生物特性,為后續(xù)評(píng)價(jià)其生物功能奠定基礎(chǔ)。方法:通過(guò)酸洗脫法從噬菌體抗體庫(kù)篩選抗CD147-scFv,用常規(guī)ELISA、DNA測(cè)序、細(xì)胞ELISA和競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)鑒定其特異性;用硫氰酸按洗脫法對(duì)其相對(duì)親和力進(jìn)行初步測(cè)定:以scFv為模板擴(kuò)增scFv輕重鏈可變區(qū),通過(guò)同源重組技術(shù)構(gòu)建全人源抗CD147 IgG1真核表達(dá)載體并在293F真核細(xì)胞獲得表達(dá);用親和層析法分離純化抗體,SDS-PAGE鑒定純化效果;用ELISA和Western Blot驗(yàn)證抗體的特異性;用CCK-8法初步測(cè)定抗體對(duì)表達(dá)CD147乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果:1、通過(guò)四輪富集性篩選,抗體獲得750倍富集;經(jīng)常規(guī)ELISA、DNA序列分析、細(xì)胞ELISA和競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)鑒定,獲得了 3個(gè)具有不同基因型序列的特異性克隆(13號(hào)、15號(hào)和168號(hào)),其輕重鏈的可變區(qū)分屬VλI/VH Ⅰ、VκⅢ/VHⅢ、和VλⅢ/VHⅢ亞群;成功進(jìn)行可溶性表達(dá)后證實(shí)三者均可與CD147特異結(jié)合。用硫氰酸銨洗脫法測(cè)出3個(gè)抗CD147-scFvs的相對(duì)親和指數(shù)(RAI)分別為0.2 mol/L、0.35 mol/L和0.6 mol/L,其中,168號(hào)的相對(duì)親和力優(yōu)于13號(hào)和15號(hào)。2、PCR擴(kuò)增3種抗CD147-scFv的VH、Vκ/λ序列,瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小正確;采用同源重組技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體,瓊脂糖凝膠電泳鑒定和DNA測(cè)序分析核實(shí),顯示成功構(gòu)建了它們的完整人源IgG1表達(dá)載體。3、輕重鏈表達(dá)載體等比例轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞,無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)3天后收集部分上清進(jìn)行ELISA檢測(cè),證實(shí)表達(dá)了完整人源抗體;繼續(xù)培養(yǎng)至第7天,收集細(xì)胞上清,采用親和層析法進(jìn)行抗體分離純化,SDS-PAGE鑒定純化后抗體純度可達(dá)95%;經(jīng)過(guò)ELISA和Western Blot兩種方法鑒定特異性,結(jié)果顯示抗體能與CD147特異結(jié)合。4、采用CCK-8法測(cè)定結(jié)合活性較好的168號(hào)抗體對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用。結(jié)論:從噬菌體抗體庫(kù)篩選出了抗CD147的特異性人源scFv,證實(shí)其特異性后在真核細(xì)胞成功表達(dá)出人源抗CD147 IgG1,并證實(shí)其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖有一定抑制作用。
【圖文】：

對(duì)抗體的特異結(jié)合活性產(chǎn)生影響，需要將單鏈抗體變成可溶性抗體。將３種不同逡逑基因型的特異性噬菌體抗體感染大腸桿菌ＨＢ２１５１，以ＩＰＴＧ誘導(dǎo)進(jìn)行可溶性表逡逑達(dá)并以ＥＬＩＳＡ檢測(cè)可溶性抗體的特異性表達(dá)情況，ＥＬＩＳＡ實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖１－４顯逡逑示：３株陽(yáng)性噬菌體抗體克隆可溶性表達(dá)后均能與ＣＤ１４７包被抗原特異結(jié)合，逡逑與無(wú)關(guān)０Ａ抗原和ＰＥＰ抗原不結(jié)合。逡逑１６逡逑

逑２．邐８噬菌體單鏈抗體的相對(duì)親和力測(cè)定逡逑ＮＨ４ＳＣＮ洗脫法實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖１－６所示，１３號(hào)、１５號(hào)、１６８號(hào)ｓｃＦｖｓ的親和逡逑力指數(shù)分別約為０．２０ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌ和０．７ｍｏｌ／Ｌ。在３種噬菌體單鏈抗體中，，逡逑１３號(hào)親和力相對(duì)較低、１６８號(hào)親和力最高。逡逑１２０0／0邋＿邐—Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７邋－１３逡逑＾邐°邐Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７－１５逡逑＾邐Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７－１６８逡逑ｆ邋１００％－邐？—逡逑ｔ＾－邋ＶＶ＼邐Ｔ逡逑Ｉ邐＼邐＼邐邐邐—邐漏逡逑Ｉ邐＼＼逡逑ｇ邋４０％邋－邐＼邐Ｔ逡逑｜邋邐１＾逡逑ｆ邋２０％邋－邐＼－N邐＊逡逑１邐＊邐－士邐＊邋一逡逑＜邐ｉ邐１逡逑０％邋－＊邐｜邐｜邐ｉ邐Ｉ邐ｌ邐Ｉ邐Ｉ逡逑０邐０．２邐０．４邐１邐１．５邐２邐３逡逑ＮＨ４ＳＣＮ（ｍｏｌ＊邋Ｕ）逡逑圖１－６硫氰酸銨洗脫法檢測(cè)相對(duì)親和力逡逑Ｆｉｇ邋１－６邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｖｉｄｉｔｙ邋ｉｎｄｅｘ邋ｂｙ邋ａｍｍｏｎｉｕｍ邋ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ邋ｅｌｕｔｉｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑注：１３、１５和１６８：邋１３號(hào)、１５號(hào)和１６８號(hào)抗ＣＤ１４７單鏈抗體逡逑Ｎｏｔｅ：邋３，邋１５邋ａｎｄ邋１６８：邋ａｎｔｉ－ＣＤ邋１４７邋ｓｃＦｖ邋ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ逡逑３．邐討論逡逑ＣＤ１４７分子參與炎癥、腫瘤、發(fā)育及其他疾病的病理發(fā)展進(jìn)程，在細(xì)胞增殖逡逑與凋亡、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與分化和腫瘤細(xì)胞耐藥中起重要作用［９＿１４］。但是目前尚未逡逑見(jiàn)到關(guān)于人源抗ＣＤ１４７抗體在腫瘤方面的相關(guān)研究。逡逑噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)是一種可以不經(jīng)免疫動(dòng)物快速制備出人源抗體的技術(shù)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2671068