【摘要】：背景:CD147(cluster of differentiation 147)是一個跨膜糖蛋白,高表達于多種腫瘤細胞,多項研究證實其參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,我們實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)敲低CD147的表達可顯著增強曲妥珠單抗對HER2陽性乳腺癌敏感細胞的抑制作用,提示CD147是一個有價值的治療腫瘤及自身免疫性疾病的靶點。目前,已有針對CD147的鼠單抗用于肝癌的靶向治療。人源抗體在體內治療應用中比鼠單抗更具優(yōu)越性,尚未見相關報道。目的:運用實驗室構建的噬菌體抗體庫篩選平臺篩選特異性人源抗CD147單鏈抗體(scFv),利用同源重組技術將scFv轉換為人源抗CD147IgG1抗體,并鑒定其生物特性,為后續(xù)評價其生物功能奠定基礎。方法:通過酸洗脫法從噬菌體抗體庫篩選抗CD147-scFv,用常規(guī)ELISA、DNA測序、細胞ELISA和競爭抑制實驗鑒定其特異性;用硫氰酸按洗脫法對其相對親和力進行初步測定:以scFv為模板擴增scFv輕重鏈可變區(qū),通過同源重組技術構建全人源抗CD147 IgG1真核表達載體并在293F真核細胞獲得表達;用親和層析法分離純化抗體,SDS-PAGE鑒定純化效果;用ELISA和Western Blot驗證抗體的特異性;用CCK-8法初步測定抗體對表達CD147乳腺癌細胞增殖能力的影響。結果:1、通過四輪富集性篩選,抗體獲得750倍富集;經常規(guī)ELISA、DNA序列分析、細胞ELISA和競爭抑制實驗鑒定,獲得了 3個具有不同基因型序列的特異性克隆(13號、15號和168號),其輕重鏈的可變區(qū)分屬VλI/VH Ⅰ、VκⅢ/VHⅢ、和VλⅢ/VHⅢ亞群;成功進行可溶性表達后證實三者均可與CD147特異結合。用硫氰酸銨洗脫法測出3個抗CD147-scFvs的相對親和指數(shù)(RAI)分別為0.2 mol/L、0.35 mol/L和0.6 mol/L,其中,168號的相對親和力優(yōu)于13號和15號。2、PCR擴增3種抗CD147-scFv的VH、Vκ/λ序列,瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶大小正確;采用同源重組技術構建表達載體,瓊脂糖凝膠電泳鑒定和DNA測序分析核實,顯示成功構建了它們的完整人源IgG1表達載體。3、輕重鏈表達載體等比例轉染HEK293F細胞,無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)3天后收集部分上清進行ELISA檢測,證實表達了完整人源抗體;繼續(xù)培養(yǎng)至第7天,收集細胞上清,采用親和層析法進行抗體分離純化,SDS-PAGE鑒定純化后抗體純度可達95%;經過ELISA和Western Blot兩種方法鑒定特異性,結果顯示抗體能與CD147特異結合。4、采用CCK-8法測定結合活性較好的168號抗體對乳腺癌細胞增殖的影響,結果顯示其對乳腺癌細胞的增殖有一定的抑制作用。結論:從噬菌體抗體庫篩選出了抗CD147的特異性人源scFv,證實其特異性后在真核細胞成功表達出人源抗CD147 IgG1,并證實其對乳腺癌細胞的增殖有一定抑制作用。
【圖文】：

對抗體的特異結合活性產生影響，需要將單鏈抗體變成可溶性抗體。將３種不同逡逑基因型的特異性噬菌體抗體感染大腸桿菌ＨＢ２１５１，以ＩＰＴＧ誘導進行可溶性表逡逑達并以ＥＬＩＳＡ檢測可溶性抗體的特異性表達情況，ＥＬＩＳＡ實驗結果如圖１－４顯逡逑示：３株陽性噬菌體抗體克隆可溶性表達后均能與ＣＤ１４７包被抗原特異結合，逡逑與無關０Ａ抗原和ＰＥＰ抗原不結合。逡逑１６逡逑

逑２．邐８噬菌體單鏈抗體的相對親和力測定逡逑ＮＨ４ＳＣＮ洗脫法實驗結果如圖１－６所示，１３號、１５號、１６８號ｓｃＦｖｓ的親和逡逑力指數(shù)分別約為０．２０ｍｏｌ／Ｌ、０．３５ｍｏｌ／Ｌ和０．７ｍｏｌ／Ｌ。在３種噬菌體單鏈抗體中，，逡逑１３號親和力相對較低、１６８號親和力最高。逡逑１２０0／0邋＿邐—Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７邋－１３逡逑＾邐°邐Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７－１５逡逑＾邐Ａｎｔｉ－ＣＤ１４７－１６８逡逑ｆ邋１００％－邐？—逡逑ｔ＾－邋ＶＶ＼邐Ｔ逡逑Ｉ邐＼邐＼邐邐邐—邐漏逡逑Ｉ邐＼＼逡逑ｇ邋４０％邋－邐＼邐Ｔ逡逑｜邋邐１＾逡逑ｆ邋２０％邋－邐＼－N邐＊逡逑１邐＊邐－士邐＊邋一逡逑＜邐ｉ邐１逡逑０％邋－＊邐｜邐｜邐ｉ邐Ｉ邐ｌ邐Ｉ邐Ｉ逡逑０邐０．２邐０．４邐１邐１．５邐２邐３逡逑ＮＨ４ＳＣＮ（ｍｏｌ＊邋Ｕ）逡逑圖１－６硫氰酸銨洗脫法檢測相對親和力逡逑Ｆｉｇ邋１－６邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ａｖｉｄｉｔｙ邋ｉｎｄｅｘ邋ｂｙ邋ａｍｍｏｎｉｕｍ邋ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ邋ｅｌｕｔｉｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑注：１３、１５和１６８：邋１３號、１５號和１６８號抗ＣＤ１４７單鏈抗體逡逑Ｎｏｔｅ：邋３，邋１５邋ａｎｄ邋１６８：邋ａｎｔｉ－ＣＤ邋１４７邋ｓｃＦｖ邋ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ逡逑３．邐討論逡逑ＣＤ１４７分子參與炎癥、腫瘤、發(fā)育及其他疾病的病理發(fā)展進程，在細胞增殖逡逑與凋亡、腫瘤細胞轉移與分化和腫瘤細胞耐藥中起重要作用［９＿１４］。但是目前尚未逡逑見到關于人源抗ＣＤ１４７抗體在腫瘤方面的相關研究。逡逑噬菌體抗體庫技術是一種可以不經免疫動物快速制備出人源抗體的技術
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 周麗英;徐小潔;李玲;王濤;張立;范忠義;鄭志兵;葉棋濃;;人Six1真核表達載體的構建及應用[J];細胞與分子免疫學雜志;2015年09期

2 黃靜;張括川;劉曉丹;王琳;張璐;趙寶華;;單鏈抗體的研究進展及其應用[J];畜牧與飼料科學;2014年11期

3 吳介恒;楊安鋼;溫偉紅;;治療性抗體用于腫瘤治療的臨床轉化研究現(xiàn)狀[J];中國腫瘤生物治療雜志;2014年03期

4 梁龍;楊華;楊永林;石國慶;劉守仁;皮文輝;;應用“酶切連接”克隆法構建TALEs[J];石河子大學學報(自然科學版);2013年03期

5 高鵬;胡立勇;錢鈺;徐晨;;噬菌體抗體庫篩選技術[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2012年23期

6 范翠英;馮利興;樊金玲;果德安;劉璇;;重組蛋白表達系統(tǒng)的研究進展[J];生物技術;2012年02期

7 馬穎;鄒全明;;單鏈抗體及其在生物醫(yī)學中的應用[J];免疫學雜志;2006年S1期

8 于華,張春秀;抗原抗體之間的相互反應及其研究方法[J];化工時刊;2004年04期

9 喬媛媛,王琰,陳曉穗,王欲曉,化冰;大容量噬菌體抗體庫的構建及鑒定[J];中華微生物學和免疫學雜志;2004年03期

10 王剛,王琰;硫氰酸鹽洗脫法測定噬菌體抗體的相對親和力[J];中華微生物學和免疫學雜志;2000年04期

本文編號：2671068