【摘要】：zika病毒近幾年在全球范圍內(nèi)爆發(fā),給人類健康造成巨大威脅。研究發(fā)現(xiàn),孕婦感染zika病毒與小頭癥嬰兒的產(chǎn)生密切相關(guān)。因此,防控zika病毒傳播成為亟待解決的問題。該病毒編碼三個結(jié)構(gòu)蛋白和七個非結(jié)構(gòu)蛋白,其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS3與NS5相互配合,共同實現(xiàn)病毒基因組RNA在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。本課題旨在研究zikaNS3蛋白的功能和作用機制,探究其是否具有依賴于ATP水解活性的dsDNA解鏈活性,并找到影響酶活性的關(guān)鍵位點,以期進(jìn)一步闡明病毒復(fù)制機制,為抑制病毒感染提供新的思路。首先構(gòu)建zika病毒NS3原核表達(dá)載體,在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)NS3蛋白,然后利用Ni柱對蛋白親和純化。利用ATPase試劑盒檢測NS3蛋白的ATP水解活性,通過檢測ATP水解速率,從而研究NS3的ATP水解活性。為研究NS3蛋白的dsDNA解鏈活性,在體外利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)原理,建立雙鏈核酸解旋系統(tǒng),以熒光值的增加判斷解鏈的發(fā)生,以此研究NS3解鏈活性大小。利用定點突變的方法,以野生型NS3載體為模板,得到NS3G198A突變克隆。在原核細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)突變體蛋白,并進(jìn)行親和純化,得到NS3 G198A蛋白。通過Western Blot對蛋白定量后,比較G198A突變體與野生型NS3的ATP水解活性和dsDNA解鏈活性。通過原核表達(dá)和親和純化,可以得到較純的zikaNS3蛋白。該蛋白在體外可以水解ATP,水解最大反應(yīng)速率為2.76μmol/(L·min),其Km值為0.11 mmol/L;并且,zikaNS3蛋白在體外可以使dsDNA解鏈;NS3 G198A突變體蛋白水解ATP的速率和解鏈dsDNA的速率,較野生型均明顯減弱。zikaNS3蛋白在體外具有依賴于ATP水解活性的dsDNA解鏈活性,198位甘氨酸是影響酶活的關(guān)鍵位點。Zika病毒為黃病毒屬,單股正鏈RNA病毒。近幾年zika病毒在全球爆發(fā),嚴(yán)重影響了人類健康,成為亟待解決的問題。Zika病毒在感染細(xì)胞時,首先通過病毒表面的E蛋白識別宿主細(xì)胞表面受體,而與細(xì)胞結(jié)合。然后再通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,之后病毒將基因組釋放到胞漿中,完成后續(xù)感染。因此,鑒定zika病毒受體,有助于闡明病毒入侵細(xì)胞的分子機制,也為抑制zika病毒感染提供有效的藥物設(shè)計靶點。本研究旨在利用新近發(fā)展的蛋白質(zhì)生物素化方法,結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù),尋找細(xì)胞表面與zika病毒E蛋白結(jié)合的分子。然后將得到的分子進(jìn)行篩選,得到與E蛋白可能相互作用的候選分子,為找到zika病毒受體奠定基礎(chǔ)。首先通過堿性磷酸酶(AP)顯色系統(tǒng),確定zikaE蛋白可以直接與細(xì)胞表面結(jié)合。具體是在真核細(xì)胞293T中表達(dá)E蛋白胞外段與AP的融合蛋白(ECD-AP)以及AP蛋白本身,收集上清并進(jìn)行純化后得到兩種蛋白。將兩種蛋白加入到zika病毒可以感染的SNB-19和GC1細(xì)胞中,結(jié)合后加入AP的底物進(jìn)行顯色反應(yīng),通過顏色的變化判斷蛋白是否與細(xì)胞結(jié)合。然后通過辣根過氧化物酶(HRP)系統(tǒng),將結(jié)合在細(xì)胞表面的E蛋白附近的蛋白生物素化。具體是在293T細(xì)胞中表達(dá)E蛋白胞外段與HRP的融合蛋白(ECD-HRP)以及HRP蛋白本身,在上清中純化后得到兩種蛋白。將蛋白結(jié)合到SNB-19和GC1細(xì)胞表面后,加入HRP的底物進(jìn)行生物素化反應(yīng),則E蛋白附近的蛋白被生物素化。將生物素化反應(yīng)后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光,用streptavidin_488抗體檢測生物素化的蛋白。將生物素化反應(yīng)后的細(xì)胞裂解,收集蛋白,并用親和素珠子純化。將得到的生物素化的蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,分析對比實驗組和對照組所鑒定到的蛋白,并結(jié)合文獻(xiàn)查閱,初步篩選出可能的E蛋白的候選受體分子。AP實驗發(fā)現(xiàn),SNB-19和GC1細(xì)胞的ECD-AP實驗組相比AP對照組,均呈現(xiàn)明顯的藍(lán)黑色產(chǎn)物;HRP實驗顯示,相比對照組,SNB-19和GC1細(xì)胞的ECD-HRP實驗組的細(xì)胞膜呈現(xiàn)較弱的熒光;無論是SNB-19還是GC1細(xì)胞,質(zhì)譜鑒定到的生物素化的蛋白種類均較少,但兩種細(xì)胞的實驗組均存在特異的差異蛋白,這些分子可能與E蛋白結(jié)合有關(guān)。zika病毒E蛋白的胞外段可以結(jié)合在SNB-19和GC1細(xì)胞表面;通過HRP系統(tǒng)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù),可以鑒定到細(xì)胞表面與E蛋白結(jié)合的分子;質(zhì)譜檢測結(jié)果為尋找zika病毒受體奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖１．１從ｐＣＤＮＡ６－ｚｉｋａ邋ＮＳ３質(zhì)粒載體中擴增ＩＶＳ３１：邋ＮＳ３邋擴增片段邐２：邋ｍａｒｋｅｒ逡逑８ａ－ｚｉｋａ邋ＮＳ３表達(dá)載體測序結(jié)果逡逑子克隆得到的ｐＥＴ２８ａ－ｚｉｋａＮＳ３載體送至公司測序。用引物進(jìn)行正向測序，使用Ｔ７邋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ通用引物ｃｈｒｏｍａｓ圖結(jié)果，確定此次測序結(jié)果較好。然后，用ＮＳ３理論序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的載體ＮＳ３序部測通。逡逑２１０邐２２０邐２３０邐２４０邐２５０邐２６０邐２７０邐２８０邐２９０邐３００邐３１０邐３２０ｎＱ３ｉ＇ＴＧＩＱＸｒＱ＾ＴＣ邋迎孤－NBＧｔＱ０

圖２．１考馬斯亮藍(lán)檢測ｚｉｋａ病毒ＮＳ３蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)逡逑為了進(jìn)一步檢測ｚｉｋａＮＳ３蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，將上述誘導(dǎo)前后的蛋白進(jìn)逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R373

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本文編號：2671202