【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本研究通過對人間充質(zhì)干細(xì)胞(Human mensenchymal stem cells,hMSCs)發(fā)育相關(guān)的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路分析,探究Wnt家族因子在hMSCs中的表達(dá)和生物學(xué)作用,以尋找能代表hMSCs發(fā)生體外復(fù)制性衰老(Replicative senescence)的一種標(biāo)志性分子,以便將來可能為hMSCs質(zhì)量評價(jià)提供新的技術(shù)策略。實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果:本課題利用Real Time-PCR檢測了不同hMSCs細(xì)胞株的不同代次中多種Wnt亞型分子基因的轉(zhuǎn)錄水平,試圖找到與復(fù)制性衰老的關(guān)系;通過不同代次hMSCs標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株,確定Wnt2亞型分子的轉(zhuǎn)錄水平與hMSCs復(fù)制性衰老的負(fù)相關(guān)性。結(jié)果顯示,Wnt2表達(dá)量普遍高于其他Wnt分子,并且不同代次hMSCs標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株中,Wnt2亞型分子的轉(zhuǎn)錄水平隨代次升高表達(dá)量下降。另外,將不同來源的hMSCs通過蛋白印跡雜交(Western blot)和ELISA進(jìn)行Wnt2蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證后,結(jié)果顯示W(wǎng)nt2蛋白表達(dá)水平和標(biāo)準(zhǔn)株一致隨代次降低;Real Time-PCR相對定量和絕對定量法檢測Wnt2也隨代次降低。此外,本研究通過Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因TCF1啟動子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)活性和β-catenin蛋白的入核遷移情況來分析判斷外源Wnt2重組蛋白是否能激活其所在的經(jīng)典信號通路。結(jié)果顯示,Wnt2可以激活經(jīng)典信號通路下游靶基因TCF1;可以誘導(dǎo)β-catenin積累入核。利用外源Wnt2重組蛋白對Wnt經(jīng)典信號下游靶基因WISP1進(jìn)行激活,證明了Wnt2/β-catenin經(jīng)典過度激活產(chǎn)生退行性病變的潛在可能。同時,本研究利用H_2O_2誘導(dǎo)的hMSCs衰老模型,進(jìn)一步探索Wnt2與hMSCs復(fù)制性衰老的相關(guān)性;利用H_2O_2衰老模型和GSK-3β抑制劑CHIR99021判斷GSK-3β與Wnt2表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示,Wnt2隨H_2O_2的濃度升高,表達(dá)量下降;GSK-3β隨衰老表達(dá)升高;GSK-3β水平的增強(qiáng)促進(jìn)了對Wnt信號的抑制作用;GSK-3β抑制劑CHIR99021一定程度上活化了Wnt2和Wnt經(jīng)典信號的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:本課題證明了Wnt2是Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路中與hMSCs復(fù)制衰老相關(guān)的關(guān)鍵Wnt分子,其表達(dá)開始被抑制時可認(rèn)為細(xì)胞步入衰老,因此可作為細(xì)胞復(fù)制衰老的新型分子標(biāo)志物,用于判斷細(xì)胞復(fù)制衰老情況。同時,可以考慮檢測Wnt2表達(dá)水平作為一種新型hMSCs質(zhì)量評價(jià)的方法。
【圖文】：

（Casein kinase，CK-I）一起結(jié)合，構(gòu)成多蛋白復(fù)合體。蛋白復(fù)合物不僅用于β-catenin，，并且復(fù)合物中 GSK-3β 磷酸化 β-catenin N-末端[13]，最終 β-catenin 被酶體降解，使細(xì)胞質(zhì)中 β-catenin 保持在低水平[14]，從而阻止 β-catenin 轉(zhuǎn)移入核轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。其中 Axin 是該復(fù)合體的限制組分，通過對 Axin 穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)直接調(diào)節(jié)多蛋白復(fù)合體的活性[15]。

溫度 時間95℃ 5 min95℃ 30 s55℃ 30 s 28 cycles72℃ 30 s72℃ 2 min3.1.1.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果將 1%瓊脂糖膠放置于有 1×TAE 的電泳槽中，使 1×TAE 沒過瓊脂糖膠的上表面，將 5 μL DNA Marker、10-20 μL PCR 產(chǎn)物分別加入瓊脂糖凝膠孔中，凝膠孔在上放在負(fù)極，紅色正極方向在下遠(yuǎn)離膠孔，將電壓調(diào)至 80 V 后開始電泳，30-60 min 后，取出瓊脂糖凝膠，關(guān)閉電泳電源，用凝膠成像儀掃描，可得圖 2：
【學(xué)位授予單位】：中國食品藥品檢定研究院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R329.2

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本文編號：2669709